Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.5. Về việc đánh giá tính an toàn của ASCs sau nuôi cấy tăng sinh
Tế bào gốc mỡ được coi là loại tế bào lý tưởng trong liệu pháp tế bào với nhiều ưu thế: là nguồn tế bào ghép tự thân, khả năng tái tạo mô mỡ trong cơ thể diễn ra khá nhanh chóng và việc thu thập chúng gây ra ít phiền phức đối với bệnh
nhân. Trong quá trình nuôi cấy trong điều kiện invitro, sự tích lũy các đột biến trong tế bào cũng tương tự như sự phân chia của tế bào trong điều kiện in vivo[29]. Vì vậy, sự đánh giá an toàn đối với các tế bào sau nuôi cấy để chuẩn bị cho các thử nghiệm lâm sàng là một việc hết sức cần thiết.
Để đánh giá sự an toàn của các ASC sau nuôi cấy tăng sinh, ngoài hình tháibình thường với hình dạng đặc trưng cho tế bào gốc trung mô của tế bào gốc mô mỡ, chúng tôi còn phân tích kiểu nhân và định lượng enzyme telomerase của các thế hệ tế bào từ P1 tới P5.
3.5.1. Khảo sát karyotype trên một số mẫu nghiên cứu
P1
P3
P5
Hình 3.6. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào gốc mỡ định dạng theo từng nhiễm sắc thể
Kiểu nhân bệnh nhân nam hình dạng và cấu trúc bình thường. (ADSC1, tọa độ 9096/-5849)
A
B
Hình 3.7. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào gốc mỡ ở lần cấy truyền thứ 5 (P5) Định dạng theo từng nhiễm sắc thể, hình dạng và cấu trúc bình thường
. (A- mẫu số 3; B- mẫu số 10)
Kết quả cho thấy, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thể hiện cấu trúc bộ nhiễm sắc thể đều bình thường về số lượng và cấu trúc ở tất cả các mẫu phân tích sau 5 lần cấy truyền, không phát hiện thấy đa bội lệch hay tứ bội thể hay bất cứ bất thường nào trong cấu trúc nhiễm sắc thể ở tất cả các mẫu nghiên cứu.. Như vậy, sự ổn định về mặt di truyền ở cấp độ tế bào ở các mẫu đem phân tích được duy trì cho tới thế hệ P5.
Trong một nghiên cứu của Marta García-Contreras và cộng sự [27], mẫu kiểu nhân từ ASCs ở thế hệ P4 của hai bệnh nhân ung thư đã được phân tích. Kết
quả cho thấy, chỉ có một điểm đa hình ở nhiễm sắc thể số 6 (đoạn 280kb) và 1 điểm đa hình xuất hiện ở nhiễm sắc thể 16 (đoạn 578kb) ở bệnh nhân thứ 1. Còn bệnh nhân thứ 5 bị mất một điểm đa hình ở 116kb trên nhiễm sắc thể Y. Những thay đổi nhỏ này vẫn được đánh giá là an toàn.
3.5.2. Định lượng enzyme telomerase
Bảng 3.6. Nồng độ Telomerase của các thế hệ tế bào nuôi cấy tăng sinh Thế hệ tế bào Nồng độ Telomerase (ng/ml)
Min Max X ± SD
P1 (n=5) 1,10 0,68 0,82 ± 0,18
P2 (n=5) 0,72 0,38 0,62 ± 0,16
P3 (n=5) 0,87 0,69 0,79 ± 0,75
P4 (n=5) 0,84 0,74 0,80 ± 0,43
P5 (n=5) 0,86 0,68 0,77 ± 0,74
P3,4,5 = 0,169 ± 0,42
Nồng độ của enzym telomerase có trong tế bào nuôi cấy đều thấp và không có sự thay đổi nhiều qua các thế hệ tế bào sau nuôi cấy tăng sinh.
Nồng độ enzym thấp nhất của các mẫu dao động từ 0,72 ng/ml đến 1,1 ng/ml. Còn nồng độ cao nhất của các mẫu dao động từ 0,38 ng/ml đến 0,68 ng/ml.
Trong đó ở các mẫu nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy nồng độ enzym thay đổi rất thấp. Ở mẫu tế bào thuộc P3, P4, P5, nồng độ enzym telomerase gần như không thay đổi với p > 0,05.
Theo các nghiên cứu trước đây, có sự khác biệt về chiều dài telomere và mức độ biểu hiện của telomerase ở các dòng tế bào: Những tế bào có khả năng tăng sinh không giới hạn (tế bào dòng sinh dục/ tế bào ung thư/ tế bào gốc phôi) đều có telomere dài cỡ 15kb, nồng độ telomerase đo được ở mức cao. Tiếp đó, dòng tế bào gốc có chiều dài telomere từ 5-15kb và nồng độ telomerase đo được ở mức thấp hoặc không đo được. Và dòng tế bào soma bình thường có telomere dài từ 2-15kb, không đo được nồng độ telomerase. Tuy nhiên, khi tế bào gốc và tế bào soma bị biến đổi thành tế bào ung thư thì chiều dài telomere rất ổn định và nồng độ của enzyme telomerase tăng cao tới hàng trăm ng/ml [31].
Hình 3.8. Chiều dài telomere và sự biểu hiện của telomerase ở một số dòng tế bào:
a) Tế bào dòng sinh dục/ tế bào ung thư/ tế bào bất tử: telomere dài ~ 15kb, Telomerase ++; b) Dòng tế bào gốc: Telomere có chiều dài từ 5-15kb, Telomerase +; c) Dòng tế bào
soma bình thường có telomere dài từ 2-15kb (theo Hiyama, 2007 )
Theo kết quả nghiên cứu chúng tôi thu được, nồng độ enzyme telomerase đo được ở các mẫu thuộc các thế hệ tế bào từ P1 tới P6 đều ở mức thấp và ổn định với nồng độ từ 0.74 – 0.85 ng/ ml, dưới ngưỡng hoạt động của telomerase ở tế bào ung thư hay tế bào gốc phôi.
Như vậy, có thể ban đầu xác nhận tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh tới thế hệ P5 đạt yêu cầu sơ bộ về tính an toàn để có thể sử dụng cho các nghiên cứu lâm sàng.