Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.3. Khả năng tạo colony của tế bào gốc mỡ
Để xác định tính gốc của tế bào tách ra từ mô mỡ, nhiều tác giả đã tiến hành các thí nghiệm về biệt hóa và xác định các dấu ấn bề mặt tế bào. Các nhóm nghiên cứu đều cho thấy tế bào gốc mỡ có khả năng biệt hóa thành sụn, xương…Đặc điểm hình thái chính xác của ASCs hiện vẫn đang được nghiên cứu. Trên thực tế, khó có thể phân biệt rõ ràng giữa ASCs, fibroblast và một số tế bào miễn dịch nếu chỉ dựa vào các quy trình phân lập và nuôi cấy chúng. Tuy nhiên, các tế bào gốc mỡ có thể được xác định bằng sự không biểu hiện (âm tính) của các marker bề mặt tế bào như CD45 (đặc hiệu cho tế bào máu), CD31 (đặc hiệu cho tế bào biểu mô) và đặc trưng bởi sự biểu hiện (dương tính) của các marker đặc hiệu tế bào gốc, bao gồm: CD29, CD34 và thụ thể α PDGF (platelet-derived growth factor), Sca-1, và CD24 [38].
Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào xác định khả năng tạo tập đoàn (colony) của các tế bào phân lập từ mô mỡ. Khả năng tạo colony là một trong những thí nghiệm thể hiện tế bào có khả năng tự đổi mới nhưng vẫn duy trì được tính di truyền của tế bào. Các tế bào đầu dòng sẽ tạo colony, thí nghiệm này đánh giá bằng test CFU-F. Để xác định tính gốc của tế bào gốc trung mô phân lập từ mô mỡ, chúng tôi đã tiến hành phân tích khả năng tạo colony nhằm đánh giá khả năng
tự đổi mới và khả năng tăng trưởng không giới hạn của chúng trong môi trường nuôi cấy phù hợp. Thông qua các kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy tế bào gốc trung mô phát triển tốt và tạo ra số lượng lớn các colony (gần 30 colony) ở mỗi đĩa nuôi cấy và đường kính của colony đạt trung bình 2mm. Điều này cho thấy, tế bào gốc trung mô phân lập được từ mô mỡ vẫn duy trì khả năng tăng trưởng mạnh mẽ đặc trưng của tế bào gốc. Kích thước colony lớn cũng gợi ý rằng chúng có khả năng tăng sinh và di cư. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, các tế bào đến thế hệ P5 vẫn có khả năng tăng sinh rất tốt, với tỷ lệ cấy truyền 1:3 thì đĩa nuôi cấy đạt đã đạt độ che phủ 80% - 90% chỉ sau 5-6 ngày, và ở các thế hệ từ P1-P5 tế bào vẫn tạo được các colony.
Bảng 3.3. Tỷ lệ tạo colony của hỗn dịch tế bào thu được từ mô mỡ (n = 5)
Thế hệ tế bào Số tế bào CFU – F min CFU – F max % CFU -F Khối tế bào mới
tách ra từ mô mỡ thử nghiệm
50 TB/cm2 08 14 13,8
Khối tế bào tính
trong 1gram mô mỡ 8,8x105 4.200 5.000 13,6
- Khối tế bào mới tách từ mô mỡ thử nghiệm (50TB/cm2): Số CFU-F tối thiểu là 8 và tối đa là 14, tỷ lệ % CFU-F là 13,8%.
- Khối tế bào tính trong 1 gram mô mỡ (8,8x105): Số CFU-F tối thiểu là 4.200, tối đa là 5.000, tỷ lệ % CFU-F là 13,6%.
Kết quả cho thấy số lượng tế bào có khả năng sinh tập đoàn của khối tế bào mới tách từ mô mỡ 6,5% ± 1,2. Qua các hình ảnh thu được, các tế bào gốc trung mô từ mô mỡ tới thế hệ P5 không phát triển thành dạng cuộn xoáy thông thường khi đạt 100% độ che phủ mà vẫn chỉ có một lớp tế bào. Các tế bào có hình thái bình thường, đặc trưng của tế bào gốc trung mô với cấu trúc tương tự nguyên bào sợi, các nhánh bào tương có xu hướng trải rộng ra như để kết nối thông tin, tín hiệu với các tế bào lân cận, trong khi một trong những đặc điểm của tế bào bất thường là mất
khả năng kết nối với môi trường và các tế bào khác. Sau khi nhuộm giemsa, nhân tế bào có hình thái tương tự như các nguyên bào sợi và bắt màu kiềm đậm. Điều này thể hiện các tế bào đang nhân lên và có khả năng phân chia tốt.
Hình 3.2. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa (mẫu số 1)
Hình 3.3. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa (mẫu số 15)
Với kết quả này, chúng tôi nhận thấy, hình thái tế bào do chúng tôi phân lập cũng tương tự như một số nghiên cứu trước đây trên tế bào gốc mỡ được nuôi cấy tăng sinh tới thế hệ P5 – P10 [39].
a) b)
c) d)
Hình 3.4. Hình thái colony của các mẫu nghiên cứu theo thời gian a) Tạo colony ngày thứ nhất, tế bào mọc ít và rải rác (độ phóng đại 50x)
b) Colony xuất hiện sau ngày thứ 5 (độ phóng đại 50x) c) Hình ảnh colony sau ngày thứ 10 (độ phóng đại 50x)
d) Colony ngày thứ 20, colony dày và các tế bào có hình sao/ thoi (độ phóng đại 100x)
Bảng 3.4. Khả năng tạo CFU-F theo các thế hệ tế bào (n=5)
Thế hệ tế bào Số tế bào/ cm2 Số CFU % CFU-F ± SD
P1 50 8 – 14 13,8 ± 1,4
P3 50 15 – 19 16,5 ± 1,9
P5 50 14 –17 17,2 ± 1,6
- Các tế bào có xu hướng tạo colony nhiều hơn khi tăng số lần cấy truyền lên đến P3, P5. Như vậy, đã có sự chọn lọc trong quá trình nuôi cấy, chỉ có những tế bào thuộc gốc trung mô có khả năng bám vào bề mặt nuôi cấy mới sống sót, còn những tế bào không thuộc trung mô sẽ chết trong các lần cấy truyền đầu tiên.
- Các thế hệ từ P1 - P5 đạt trung bình 16,3% CFU-F tùy vào thế hệ tế bào thử nghiệm. Kết quả khả năng tạo CFU-F quan sát được thấp hơn nghiên cứu trước đây trên đối tượng mô mỡ của người khỏe mạnh [4], có thể do mẫu mô chúng tôi lấy đa số từ người lớn tuổi (trên 60 tuổi), có vết thương mạn tính và khoảng 60% số bệnh nhân có bệnh kết hợp).