CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4
QH.2014.T.CH - 60420121 23
Hình 2.1. Các bước thí nghiệm nghiên cứu đa hình genOsHKT2;4
2.2.1.1. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của 14 mẫu lúa đƣợc tách chiết từ mẫu lá cây lúa trồng trong đất khoảng 2 – 3 tuần. Mẫu đƣợc nghiền nhỏ bằng máy nghiền mẫu Mixer mill (Retsch, CHLB Đức) ở nhiệt độ lạnh sâu, sau đó tiến hành tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB.
50mg mẫu lỏ đƣợc nghiền nhỏ, sau đú bổ sung thờm 500àl đệm CTAB, hỗn hợp đƣợc chứa trong ống ly tâm 1,5ml và đƣợc trộn đều bằng máy votex. Sau khi ủ ở 65OC trong 15 phỳt, mẫu đƣợc để nguội ở nhiệt độ phũng và bổ sung 500àl Chloroform-Isoamylacohol (tỷ lệ 24:1), tiếp tục trộn đều bằng máy votex. Ly tâm mẫu ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4OC. Sau khi ly tâm, tiến hành thu dung dịch bờn trờn và chuyển sang ống ly tõm mới. Bổ sung 300àl Isopropanol và giữ ở nhiệt độ lạnh trong 10 phút, sau đó ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4OC.
Thu tủa DNA và rửa bằng 500àl EtOH 70%. Ly tõm thu lại tủa ở 14.000 vũng/phỳt Tách chiết DNA tổng số
Điện di kiểm tra Khuếch đại vùng chứa gen
Điện di kiểm tra
Giải trình tự Phân tích đa hình
QH.2014.T.CH - 60420121 24
trong 5 phút ở 4OC. Để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ Hood trong khoảng 60 phút, sau đó hòa tan tủa DNA trong đệm TE và bảo quản ở -20OC.
DNA sau khi tách chiết đƣợc kiểm tra nồng độ và chất lƣợng bằng các điện di trên gel agarose 1% và đo OD bằng máy Nanodrop Spectrophotometer (Nanodrop Technologies, Mỹ).
2.2.1.2. Khuếch đạigen bằng phản ứng PCR
Gen quan tõm đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR với thể tớch 50àl với cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu dựa trên trình tự genOsHKT2;4 đã đƣợc công bố trên các cơ sở dữ liệu.
Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại genOsHKT2;4:
ddH2O 35,2 àl
DNA khuụn (10ng/àl) 1,5 àl
10X Taq buffer (+Mg2+) 5 àl
2mM dNTPs 5 àl
Mồi Fw (10 àM) 1,5 àl
Mồi Rv (10 àM) 1,5 àl
Taq polymerase (5U/àl) 0,3 àl Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Biến tính bước đầu: 94OC 5’
Chu trình nhiệt: 32 chu kỳ
o Biến tính: 94OC 30”
o Gắn mồi: 56OC 15”
o Kéo dài: 72OC 1’20”
Kéo dài bổ sung: 72OC 7’
Bảo quản: 4OC ∞
QH.2014.T.CH - 60420121 25
2.2.1.3. Điện di trên gel agarose
Điện di là một phương pháp phổ biến và đơn giản sử dụng trường điện từ để phân tách và xác định các phân đoạn nucleotide acid với kích thước khác nhau.
Điện di trên gel agarose sử dụng gel agarose với cấu trúc lưới gồm các lỗ gel. Trong quá trình di chuyển trong trường điện từ, các phân tử có kích thước nhỏ hơn sẽ dễ dàng đi qua các lỗ gel do đó sẽ di chuyển về phía cực dương nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn.
5àl mẫu đƣợc trộn đều với 1àl dye 6X, mẫu đƣợc chạy trờn gel agarose 1- 2% ở 90V trong 25-35 phút trong điều kiện tối sau đó đƣợc nhuộm với EtBr trong vòng 3 - 15 phút và được kiểm tra dưới đèn cực tím. Kích thước tương đối của sản phẩm đƣợc xác định dựa vào thang chuẩn 1Kb hoặc thang chuẩn 100bp.
2.2.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc kiểm tra trên gel agarose đƣợc tinh sạch bằng kit GeneJET ® PCR Purification (Thermo Scientific) và được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA sau khi tinh sạch đƣợc giải trình tự bằng máy giải trình tự ABI PRISM 3730xl Genetic Analyzer bởi công ty First Base (Singapore). Kết quả giải trình tự đƣợc phân tích trên phần mềm Chromas và BioEdit, sau đó chúng tôi sử dụng công cụ Clustal Omega của European Bioinformatics Institute và công cụ Multiple sequence alignment (MultAlin) để so sánh các trình tự.
2.2.1.5. Dự đoán cấu trúc protein OsHKT2;4
Kết quả giải trình tự sau khi phân tích đa hình nucleotide đƣợc sử dụng để xây dựng và dự đoán cấu trúc protein HKT2;4. Trình tự nucleotide đƣợc loại bỏ vùng intron và đƣợc phiên mã sang trình tự amino acid bằng công cụ Translator. Từ trình tự amino acid thu đƣợc, mô hình cấu trúc protein bậc ba và mô hình cấu trúc xuyên màng đƣợc dự đoán và xây dựng bằng công cụ Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0 (PHYRE 2) của Structural Bioinformatics Group, kết quả đƣợc đọc trên hệ thống phần mềm JMol, Chimera và đƣợc kiểm tra độ tin cậy qua phân tích Ramachandran Plot Analysis.
QH.2014.T.CH - 60420121 26