CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen
Các phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện genOsHKT2;4 được chúng tôi tiến hành theo sơ đồHình 2.5
Hình 2.2.Các bước thực hiện thí nghiệm phân tích biểu hiện genOsHKT2;4
2.2.2.1. Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn
Hạt giống đƣợc ngâm ủ 4 ngày trong điều kiện tối. Hạt lúa sau khi nảy mầm đƣợc chuyển sang khay chứa dncnung dịch thủy canh Yoshida. Sau 1 tuần, cây lúa đƣợc chuyển vào growth chamber với điều kiện 12 giờ chiếu sáng ở 26OC và 12 giờ tối ở 22OC. pH của dung dịch thủy canh đƣợc duy trì trong khoảng 5.0 – 5.5 và đƣợc thay mới hàng tuần.
Ba nhóm mẫu đƣợc đánh dấu: nhóm cây đối chứng (không xử lý mặn); nhóm cây bị xử lý mặn ở nồng độ 50 mM và nhóm cây bị xử lý mặn ở nồng độ 100 mM.
Sau 14 ngày trồng trong dung dịch dinh dƣỡng, thí nghiệm xử lý mặn đƣợc tiến hành ở hai nhóm cây bị xử lý mặn bằng cách bổ sung NaCl vào dung dịch dinh
Trồng lúa thủy canh trong growth chamber
Xử lý mặn
Tách chiết RNA tổng số, xử lý DNAse
Tổng hợp cDNA
Phân tích biểu hiện gen bằng phản ứng Real-time PCR
QH.2014.T.CH - 60420121 27
dưỡng để đạt nồng độ tương ứng là 50 mM và 100 mM. Nhóm đối chứng không bổ sung NaCl vào dung dịch dinh dƣỡng.
Hình 2.3.Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn
Mô lá và mô rễ đƣợc thu thập ở cả 3 nhóm mẫu tại các thời điểm 1h, 3h, 5h, 24h, 48h,72h và 7 ngày sau khi xử lý mặn. Các mẫu thu đƣợc tại mỗi thời điểm sẽ được nghiền ngay trong nitơ lỏng và được lưu trữ ở -80oC để sử dụng làm vật liệu cho phân tích biểu hiện gen.
2.2.2.2. Tách chiết RNA tổng số và xử lý với DNaseI
Chúng tôi sử dụng kit GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit của Thermo Scientific để tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá.
Mẫu mô lá sau khi đƣợc nghiền nhỏ sẽ đƣợc trộn đều với đệm Lysis, ly tâm hỗn hợp và thu dịch nổi pha trên. Dịch nổi đƣợc bổ sung cồn tuyệt đối và chuyển lên cột lọc chứa màng gel silica có ái lực với nucleotide acid và đƣợc rửa với Wash Buffers. RNA đƣợc thu rửa giải bằng dung dịch Nuclease-Free. RNA sau khi thu được sẽ được lưu trữ ở nhiệt độ -80OC.
QH.2014.T.CH - 60420121 28
Để loại bỏ DNA trong mẫu, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu sau khi tách với DNaseI. 20àl mẫu RNA đƣợc bổ sung 1àl DNaseI (1U/àl) và 1àl Buffer, ủ ở 37OC trong 30 phút. DNaseI sau đó đƣợc gây ức chế hoạt động bằng cách ủ ở 70OC trong 15 phỳt với 1àl EDTA 50 mM.
2.2.2.3. Tổng hợp cDNA và Real-time PCR
RNA sau khi đƣợc xử lý DNAseI đƣợc dùng làm nguyên liệu để tổng hợp cDNA. Chúng tôi sử dụng kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit của Thermo Scientific và thực hiện theo quy trỡnh: 2àl mẫu RNA tổng số đƣợc trộn đều với 1àl mồi oligodT và 9àl H2O, hỗn hợp đƣợc ủ ở 65OC trong 5 phỳt và đƣợc làm lạnh nhanh trờn nước đỏ trong 1 – 2 phỳt. Sau đú bổ sung 4àl 5X Reaction Buffer, 1àl RiboLock Rnase Inhibitor (20U/àl), 2àl dNTPs 10mM và 1àl Revert Aid M- MuLV RT (200U/àl); hỗn hợp đƣợc ủ ở 42OC trong 60 phỳt, sau đú ủ ở 70OC trong 5 phút.
Để đánh giá mức độ biểu hiện của genOsHKT2;4, chúng tôi định lƣợng mRNA thông qua phản ứng Real-time PCR. cDNA sau khi tổng hợp đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với mồi RT-HKT2;4 và mồi Actin. Thành phần của phản ứng với tổng thể tớch 20 àl bao gồm:
cDNA 1 àl
2X SYBR Green mix 10 àl
Mồi Fw RT 4 àM 1 àl
Mồi Rv RT 4 àM 1 àl
H2O 7 àl
Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time PCR
1 chu kỳ 95OC 10 phút
40 chu kỳ
o 95OC 15”
o 60OC 1 phút
QH.2014.T.CH - 60420121 29
Sản phẩm của phản ứng khuếch đại sẽ đƣợc định lƣợng ngay khi phản ứng đang diễn ra nhờ tín hiệu huỳnh quang. Nồng độ sản phẩm đƣợc phân tích dựa trên cường độ tín hiệu huỳnh quang.
Mức độ khác biệt về nồng độ mRNA trong các mẫu đƣợc tính dựa trên công thức (Ct):
N= 2-(Ct)
Trong đó Ct là giá trị thể hiện mức độ khác biệt của các mẫu thí nghiệm so với đối chứng nội tại Actin; (Ct) là giá trị thể hiện mức độ khác biệt của các mẫu xử lý mặn so với mẫu đối chứng thí nghiệm; N là chỉ số Fold change [62].
QH.2014.T.CH - 60420121 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GENOsHKT2;4 ở LÚA
Trong nghiên cứu này, các đa hình trình tự nucleotide của genOsHKT2;4ở các giống lúa khác nhau đƣợc xác định dựa trên kết quả giải trình tự sản phẩm PCR khuếch đại vùng trình tự chứa gen bằng cặp mồiđặc hiệu. Dựa vào việc xác định các đa hình trình tự nucleotide, chúng tôi dự đoán sự thay đổi trình tự amino acid suy diễn, qua đó dự đoán ảnh hưởng của đa hình đến cấu trúc và chức năng của protein OsHKT2;4.
DNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá của các giống lúa sau đó đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu vùng trình tự chứagenOsHKT2;4.Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra, giải trình tự bằng máy giải trình tự ABI PRISM 3730xl Genetic Analyzer. Tiếp theo, trình tự nucleotide đƣợc phân tích và so sánh.