CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
3.1.4. Phân tích đa hình gen OsHKT2;4
Đa hình nucleotide phân chia đối tượng nghiên cứu thành 2 nhóm
Kết quả giải trình tự nucleotide của các mẫu đƣợc so sánh với trình tựgenOsHKT2;4 trong cơ sở dữ liệu về lúa Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml) bằng công cụ Clustal Omega và công cụ MultAlin . Kết quả cho thấy có 12 vị trí đa hình, trong đó có 9 vị trí đa hình nằm trong vùng exon, 3 vị trí đa hình trong vùng intron. Dựa trên các đa hình, các giống lúa nghiên cứu đƣợc chia thành 2 nhóm: nhóm có trình tự giống với cơ sở dữ liệu, bao gồm các giống lúa Nipponbare, Nếp vải, Ré nước, Nếp cúc, Hom râu, Ngoi, Chành trụi; và nhóm có sự sai khác với trình tự trên cơ sở dữ liệu, bao gồm các giống lúa Cườm dạng 2, Nếp nõn tre, Nước mặn dạng 2, Chiêm cũ, Nếp ốc, Tẻ tép và Pokkali (Bảng 3.1)
Bảng 3.1:Hai nhóm giống lúa phân chia theo các đa hình nucleotide
Nhóm 1
(Trình tự tương đồng với cơ sở dữ liệu)
Nhóm 2
(Trình tự sai khác với cơ sở dữ liệu) Nipponbare - Chuẩn mẫn cảm Pokkali - Chuẩn kháng mặn
Nếp vải Cườm dạng 2
Ré nước Nếp nõn tre
Nếp cúc Nước mặn dạng 2
Hom râu Chiêm cũ
Ngoi Nếp ốc
Chành trụi Tẻ tép
Trình tự nucleotide của các giống trong các nhóm là hoàn toàn giống nhau.
QH.2014.T.CH - 60420121 34
Kết quả so sánh các trình tự bằng công cụ Clustal Omega và công cụ MultAlin đƣợc thể hiện trên Hình 3.4 và trong Phụ lục 1. Vị trí các đa hình trình tự nucleotide ở hai nhóm giống lúa đƣợc tóm tắt trong Bảng 3.2.
Hình 3.4.Một phần kết quả so sánh các trình tự bằng công cụ MultAlin
QH.2014.T.CH - 60420121 35
Bảng 3.2:Vị trí các đa hình nucleotide ở nhóm 2
Vị trí nucleotide Đa hình
50 C/T
68 A/C
175 G/A
214 A/G
269 C/T
416 C/T
663 C/T
775 C/T
1043 G/A
1185 –/C
1189 G/A
1510 G/A
Đa hình nucleotide dẫn đến đa hình amino acid suy diễn
Chúng tôi tiến hành phân tích ảnh hưởng của đa hình nucleotide đến trình tự amino acid. Trình tự nucleotide thu đƣợc đƣợc loại bỏ phần intron và đƣợc dịch mã sang trình tự amino acid bằng công cụ Translator. Kết quả cho thấy 9 vị trí đa hình nucleotide trên vùng exon dẫn đến thay đổi 8 amino acid.
QH.2014.T.CH - 60420121 36
Bảng 3.3:Các đa hình amino acid tương ứng với đa hình nucleotide
Đa hình nucleotide Đa hình amino acid
50 C/T 11 S / F
68 A/C 17 N / T
175 G/A 53 V / M
214 A/G 66 T / V
269 C/T 84 T / I
416 C/T 133 S / L
663 C/T Đồng nghĩa
775 C/T 253 L / F
1043 G/A 342 S / N
1185 –/C Intron
1189 G/A Intron
1510 G/A Intron
Dự đoán cấu trúc của protein OsHKT2;4
Cấu trúc của protein OsHKT2;4 đƣợc dự đoán bằng công cụ PHYRE 2 của Structural Bioinformatics Group nhằm so sánh và phân tích ảnh hưởng của đa hình nucleotide đến cấu trúc protein. Kết quả mô hình dự đoán cấu trúc của protein OsHKT2;4 đƣợc thể hiện ở Hình 3.5.
QH.2014.T.CH - 60420121 37
Hình 3.5. Mô hình dự đoán cấu trúc bậc ba protein OsHKT2;4 của hai nhóm giống lúa
A, B. Mô hình dự đoán cấu trúc protein OsHKT2;4 ở nhóm 1 C, D. Mô hình dự đoán cấu trúc protein OsHKT2;4 ở nhóm 2 Các amino acid đa hình được đánh dấu vị trí tương ứng trên mô hình
Kiểm tra các mô hình bằng Ramachandran Plot Analysis cho thấy các mô hình đƣợc xây dựng đều có độ tin cậy cao.
- Chỉ số Number of residues in favoured region (98.0% expected) đạt 89.1% đối với mô hình nhóm 1, đạt 88.3% với mô hình nhóm 2;
- Chỉ số Number of residues in allowed region (2.0% expected) là 8.5%
với mô hình nhóm 1 và 9.7% với mô hình nhóm 2.
A
B
C
D
QH.2014.T.CH - 60420121 38
Hình 3.6. Phân bố góc quay của các amino acid trong mô hình cấu trúc 3D qua phân tích Ramachandran Plot
A. Nhóm giống lúa 1, B. Nhóm giống lúa 2.
A
B
QH.2014.T.CH - 60420121 39
Từ mô hình cấu trúc bậc ba, chúng tôi xác định đƣợc vị trí của 6 trong 8 amino acid đa hình(trừ 2 amino acid thứ 11 và 17 ở đoạn Signal peptide N- Terminal) (Hình 3.5.A, B). Trong đó có ba vị trí đa hình nằm trong cấu trúc xoắn helix:
- Vị trí đa hình amino acid thứ 53 là sự thay đổi giữa Valine của nhóm giống lúa 1 với Methionine của nhóm giống lúa 2 (Hình 3.5.A, B). Hai amino acid này có tính chất vật lý tương đối giống nhau và đều là các amino acid tan trong nước. So sánh trên hai mô hình cấu trúc bậc ba, các amino acid này không tạo ra khác biệt trong cấu trúc của protein OsHKT2;4 (Hình 3.5.A, B)
Hình 3.7. Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 53 và 253 A. Valine; B. Methionine; C. Leucine; D. Phenylalanine
A B
C D
QH.2014.T.CH - 60420121 40
- Vị trí đa hình amino acid thứ 253 là sự thay đổi giữa Leucine của nhóm giống lúa 1 với Phenylalanine của nhóm giống lúa 2 (Hình 3.5. A, B). Độ tan của hai amino acid này là khá tương đồng (ở 25OC, khả năng tan trong nước của Leucine là 24,26g/l, của Phenylalanine là 26,40g/l).
- Vị trí đa hình amino acid thứ 342 là sự thay đổi giữa Serine của nhóm giống lúa 1 với Asparagine của nhóm giống lúa 2 (Hình 3.8.). Với các đặc tính vật lý, hóa học khác biệt, đặc biệt là tính tan (Serine tan tốt trong nước với khả năng tan ở điều kiện thông thường là 425g/l, trong khi Asparagine tương đối ít tan, với khả năng tan trong nước ở điều kiện thông thường là 29,4g/l), các amino acid này có thể đã làm thay đổi tính kị nước của các cấu trúc lân cận, qua đó làm ảnh hưởng đến cấu trúc xuyên màng.
Hình 3.8. Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 342 A. Serine; B. Asparagine
Để làm rõ điều này, chúng tôi tiến hành dự đoán cấu trúc xuyên màng của protein OsHKT2;4. Đối với các protein vận chuyển, cấu trúc xuyên màng của protein là rất quan trong và có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein đó. Dự đoán cấu trúc xuyên màng của 2 nhóm đa hình, chúng tôi nhận thấy sự khác biệt rõ rệt (Hình 3.9.).
A B
QH.2014.T.CH - 60420121 41
Ngoài sự xuất hiện của các đa hình amino acid trên vùng liên kết (amino acid thứ 66, 84, 133) và đoạn signal peptide N-terminal (amino acid thứ 11 và 17) còn có các đa hình trên vùng xuyên màng ở vị trí amino acid thứ 53 và 253; kết quả này phù hợp với kết quả dự đoán cấu trúc bậc ba protein OsHKT2;4. Vị tríamino acid thứ 342 dẫn đến sự xuất hiện thêm một vùng xuyên màng thay thế một Re-entrant helix (amino acid thứ 321 đến 353). Đặc biệt vùng Re-entrant helix (của nhóm giống lúa 1) và vùng xuyên màng S7 (của nhóm giống lúa 2) có chứaamino acid Glycine số 347, một trong bốn amino acid Glycine của Filter Pore(Hình 3.10.).
1
1 1
7
2 53 6
6 8 4
1 33
3 42 11
53 17 84
11
66
133 253 11
342
A
B
Hình 3.9. Mô hình dự đoán cấu trúc xuyên màng A. Cấu trúc xuyên màng của protein OsHKT2;4 nhóm giống lúa 1, B. Cấu trúc xuyên màng của protein OsHKT2;4 nhóm giống lúa 2.
QH.2014.T.CH - 60420121 42
Hình 3.10.Filter pore của protein OsHKT2;4 ở hai nhóm giống lúa A,C. Nhóm giống lúa 1; B, D. Nhóm giống lúa 2.
Nhƣ vậy, filter pore của protein OsHKT2;4 ở cả hai nhóm đều có đầy đủ bốn glycine quan trọng quyết định tính đặc hiệu vận chuyển ion, tuy nhiên ở nhóm giống lúa 1, Glycine 347 nằm ở vùng Re-entrant helix, còn ở nhóm giống lúa 2, Glycine 347 nằm ở vùng xuyên màng. Để hiểu rõ hơn về ảnh hưởng của đa hình amino acid vị trí 342 đến hoạt động của filter pore, cần có các thí nghiệm kiểm chứng.
A B
D C
QH.2014.T.CH - 60420121 43