CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.3. Phương pháp đánh giá hiệu lực vắc xin BSL.PS 100 do
2.6.3.1. Bố trí thí nghiệm
Sử dụng 12 lợn nuôi thịt, 3 tuần tuổi (8 lợn cái, 4 lợn đực) của trại ông Lưu Văn Nhiệm, xã Đồng Sơn - thành phố Bắc Giang đã được tiêm và chưa được tiêm vắc xin phòng PRRS để công cường độc. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Nhóm lợn Lợn số Lịch tiêm vắc xin
Liều tiêm Tuổi lợn Vị trí tiêm Được tiêm một mũi
vắc xin 1, 2, 3, 4, 5
2 ml/mũi 3 tuần Bắp thịt sau gốc tai Được tiêm hai mũi
vắc xin
10, 11, 12
Đối chứng 6, 7, 8, 9 Không tiêm vắc xin Tiêm vắc xin mũi hai sau mũi một 28 ngày.
Chỉ tiêu đánh giá
Chỉ tiêu Thời gian theo dõi
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng - Hàng ngày (cả sáng và chiều)
- Kiểm tra nhiệt độ - Hàng ngày (đo vào buổi sáng từ 7-9 giờ) - Lấy máu đếm bạch cầu - Ngày 0, 4, 7, 10, 14, 21 sau công cường độc - Ngày 0, 4, 7, 14, 21 sau công cường độc - Lấy máu kiểm tra kháng thể
2.6.3.2. Phương pháp ELISA gián tiếp
ELISA là một trong những phương pháp quan trọng để xác định kháng thể PRRS trong huyết thanh. ELISA có nhiều loại trực tiếp, gián tiếp, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng ELISA gián tiếp để phát hiện kháng thể PRRS trong huyết thanh của 12 lợn thí nghiệm.
a. Nguyên lý chung
Thực chất của phản ứng ELISA sử dụng kháng thể hoặc kháng kháng thể có gắn enzyme cho kết hợp trực tiếp hay gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó cho cơ chất vào. Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hay kháng kháng thể có gắn enzyme không bị rửa trôi. Enzyme sẽ giải phóng cơ chất tạo lên màu. Khi so màu bằng quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng.
b. Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất cần dùng Bộ kít INDEXX Herd Check gồm:
- Đĩa nhựa 96 giếng - Đối chứng dương, âm
- Nước rửa (washing concentrate) 10X. Khi rửa phải pha nước rửa thành nồng độ 1X (1/10 nước rửa 10X và 9/10 nước cất).
- Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Diluent)..
- Antiporcine HRPO conjugate- kháng kháng thể có gắn enzyme.
- TMB (3, 3, 5, ,5 tetra methyl benzidine) substrate - hỗn hợp chất phát màu và cơ chất của phản ứng ELISA.
- Dung dịch dừng phản ứng (Stop solution).
Mẫu huyết thanh cần chẩn đoán.
Dụng cụ phòng thí nghiệm bao gồm: máng để đổ nguyên liệu, pipet đơn, đa kênh, máy đọc ELISA...
c. Cách tiến hành
* Chuẩn bị
+ Chuẩn bị mẫu huyết thanh bằng cách pha loãng huyết thanh cần kiểm tra ở nồng độ 1/40 (10 l huyết thanh + 390 l PBS).
+ Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng: Trước khi làm phản ứng, lấy nguyên liệu ra để ở nhiệt độ phòng từ 5- 10 phút.
+ Chuẩn bị đĩa phản ứng.
* Các bước tiến hành
- Bước 1: Nhỏ đối chứng dương và âm theo đúng sơ đồ đĩa ELISA (trang 38), với lượng 100 l.
- Bước 2: Nhỏ mẫu huyết thanh đã chuẩn bị vào vị trí từ 1 đến 46 theo theo đúng sơ đồ trang 38. Mỗi giếng nhỏ lượng 100 l.
- Bước 3: Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bước 4: Rửa đĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 l dung dịch rửa.
- Bước 5: Nhỏ 100 l conjugate vào tất cả các giếng - Bước 6: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Bước 6: Rửa đĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 l dung dịch rửa.
- Bước 7: Nhỏ 100 l TMB
- Bước 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.
- Bước 9: Nhỏ 100 l dung dịch dừng phản ứng.
- Bước 10: Đọc kết quả ở bước sóng 650 nm, nhờ máy đọc ELISA Labsystems multiskan MS.
- Bước 11: Tính kết quả dựa vào công thức S/P =
OD mẫu PRRS - OD mẫu NHC OD pos PRRS - OD pos NHC
* Lưu ý:
Kết quả ELISA chính xác cần thoả mãn các điều kiện sau:
+ PC (PRRS) - NC (PRRS) ≥ 0,15 + PC (NHC) ≤ 0,12
+ NC (NHC) ≤ 0,25
Sơ đồ đĩa ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC
A ĐC + ĐC+ 7 7
B ĐC- ĐC -
C 1 1
D 2 2
E 3 3
F 4 4
G 5 5
H 6 6 46 46
2.6.4. Phương pháp đếm bạch cầu
Bạch cầu là những tế bào máu có vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ cơ thể nhờ chức năng thực bào và chức năng miễn dịch. Do đó sự biến động số lượng bạch cầu của lợn thí nghiệm là một chỉ tiêu quan trọng.
* Nguyên liệu cần sử dụng là:
- Acid acetic 1% (1ml acid acetic trong 99 ml nước khử ion). Sau khi pha bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- Chất chống đông EDTA.
- Buồng đếm Newbauer.
- Kính hiển vi
* Các bước chuẩn bị:
+ Lấy máu cho vào ống efpendof có chứa chất chống đông EDTA.
+ Trộn đều mẫu máu bằng máy vortex.
+ Cho 100 l máu vào ống efpendof có chứa 900 ul acid acetic.
+ Trộn đều hỗn hợp bằng máy vortex.
* Cách đếm bạch cầu:
+ Trộn đều hỗn hợp trong ống efpendof một lần nữa
+ Đặt lamen lên buồng đếm Newbauer nhỏ mẫu máu vào buồng đếm sao cho mẫu vừa láng đều trên buồng đếm.
+ Đếm bạch cầu ở 4 ô vuông lớn ở 4 góc rồi lấy trung bình Công thức tính
Số lượng bạch cầu/l máu = Số bạch cầu đếm được x 100/1l máu Đơn vị l máu tương đương với mm3 máu.
2.6.5. Đề xuất biện pháp phòng chống dịch
CHƯƠNG 3