CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2.3. Các thí nghiệm được khảo sát trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn ở mức chọn lọc sơ khởi đối với nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trên môi trường PDAP.
o Mục đích
- Khảo sát và đánh giá khả năng đối kháng , duy trì khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với nấm F. oxysporum. gây bệnh héo vàng, thối củ.
- Chọn lọc những chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng và duy trì khả năng đối kháng cao để khảo sát ở những thí nghiệm tiếp theo.
o Chuẩn bị
- Những chủng vi khuẩn được nhân lại sau 48 giờ trên môi trường King’B.
- Nấm Fusarium spp. được nhân lại 5 ngày trên môi trường PDA.
o Tiến hành
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 lần lập lại, mỗi chủng vi khuẩn được xem là một nghiệm thức.
- Thí nghiệm được tiến hành trong đĩa petri trên môi trường PDAP với 4 điểm xung quanh cỏch tõm 2.5 cm là 3 khoanh giấy thấm ứ = 5 mm thấm 109 cfu/ml huyền phù vi khuẩn và 1 khoanh giấy thấm tẩm nước cất làm đối chứng; ở giữa là khoanh khuẩn ty Fusarium với ứ = 7 mm.
- Các đĩa petri được đặt trong tủ định ôn với nhiệt độ 300C.
o Chỉ tiêu theo dõi
- Tiến hành lấy chỉ tiêu khi rìa của khuẩn ty phát triển đến điểm đối chứng (4 ngày sau thí nghiệm).
- Đo khoảng cách vùng ức chế (bán kính vành khăn) của vi khuẩn đối kháng.
Mỗi điểm trắc nghiệm đo theo hai đường thẳng vuông góc qua tâm của khuẩn lạc, nhưng không tính đường kính của khuẩn lạc, đo từ rìa của khuẩn lạc đến đầu sợi nấm (bán kính vành khăn vô khuẩn).
- Việc đánh giá khả năng ức chế của các chủng vi khuẩn đối kháng dựa vào thang đáng giá của Jackson và ctv. (1991).
1: đối kháng với sự tăng trưởng của mầm bệnh và mầm bệnh bị ngừng tác động.
1/2: đối kháng với sự tăng trưởng của mầm bệnh và mầm bệnh vẫn còn phát triển được.
2/1: mầm bệnh tăng trưởng vượt trội đối kháng nhưng đối kháng vẫn còn phát triển được.
2: Mầm bệnh phát triển vượt trội đối kháng và đối kháng bị dừng lại.
3: Ức chế lẫn nhau với vùng ức chế 1-3 mm.
4: Vùng ức chế > 4 mm.
- Đo bán kính khuẩn lạc nấm Fusarium ở nghiệm thức có vi khuẩn và đối chứng để tính hiệu suất đối kháng:
- Đánh giá cấp độ hiệu quả của hiệu suất đối kháng được dựa vào thang đánh giá của Soytong (1988, trích dẫn bởi Noveriza và Quimio, 2004).
++++: tác động đối kháng rất cao (>75 %) +++: tác động đối kháng cao (61-75 %) ++ : tác động đối kháng trung bình (51-60 %) + : tác động đối kháng thấp (<50 %)
- : không biểu hiện
HSĐK: hiệu suất đối kháng (%) BKKL: bán kính khuẩn lạc
Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng đối kháng giữa các chủng vi khuẩn có triển vọng với 3 loài nấm Fusarium oxysporum gây bệnh.
o Mục đích
So sánh và đánh giá khả năng đối kháng của 17 chủng vi khuẩn có triển vọng đã chọn từ những nghiên cứu trước (Trần Vũ Phến, 2010) với nấm F. oxysporum gây bệnh thối củ gừng.
BKKL đc - BKKL vk
HSĐK (%) = --- x 100 BKKL đc
Khoanh khuẩn ty ĐC
VK1
VK2
VK3
Hình 2.2: Phương pháp trắc nghiệm khả năng đối kháng của vi khuẩn đối với nấm Fusarium spp. trên môi trường PDAP (Vincent, 1947).
o Tiến hành
Thí nghiệm tiến hành trong đĩa petri (môi trường PDAP), 5 lần lặp lại, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố:
+ Nhân tố A là 3 dòng nấm gây bệnh.
+ Nhân tố B là 17 chủng vi khuẩn đối kháng bao gồm 12 chủng triển vọng chọn lọc từ thí nghiệm 1 và 5 chủng đối kháng tốt với F. oxysporum gây bệnh héo vàng trên cà chua từ các thí nghiệm trước đó là PGPR1, PGPR6, PGPR14, PGPR17, PGPR31.
- Tiến hành tương tự thí nghiệm 2.
o Chỉ tiêu theo dõi:
Tương tự thí nghiệm 2.
Thí nghiệm 3: Khảo sát cơ chế đối kháng của một số chủng vi khuẩn có triển vọng theo khả năng tiết enzyme chitinase phân giải chitin.
o Mục đích
- Khảo sát sơ khởi cơ chế đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ.
o Chuẩn bị
- Chuẩn bị colloidal chitin + Chitin: 40 g
+ Xây min khô rồi khuấy (30-50 phút) hòa tan trong 400 ml HCl đậm đặc.
+ Làm kết tủa colloidal chitin bằng cách rót chậm dung dịch vào 2 lít nước cất giữ lạnh ở 5-100C.
+ Lọc qua giấy lọc thô và thu phần trên giấy lọc, rồi rửa bằng cách cho chúng vào 5 lít nước rồi lọc lại. Rửa ít nhất 3 lần hoặc đến khi huyền phù đạt pH =3.5.
+ Huyền phù colloidal chitin sau khi autoclaved được bảo quản lâu dài ở nhiệt độ phòng.
- Những chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm F.oxysporum qua thí nghiệm 2 được nhân lại 48 giờ trên môi trường King’s B lỏng.
o Tiến hành
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi chủng vi khuẩn là một nghiệm thức, được lặp lại 5 lần.
- Thí nghiệm được tiến hành trong đĩa petri trên môi trường chitin agar (có 4%
colloidal chitin) với 5 điểm là 5 khoanh giấy thấm ứ = 5 mm thấm huyền phự vi khuẩn - Các đĩa petri được đặt trong tủ định ôn với nhiệt độ 300C.
o Chỉ tiêu theo dõi
- Đường kính và thời gian chitin bị phân giải ở thời điểm 1, 7 và 14 ngày sau thí nghiệm .
Thí nghiệm 4: Khảo sát cơ chế đối kháng của một số chủng vi khuẩn có triển vọng theo khả năng tiết siderophore.
o Mục đích
Khảo sát cơ chế đối kháng của các chủng vi khuẩn theo khả năng tiết siderophore để cạnh tranh về dinh dưỡng.
o Tiến hành
Theo phương pháp được mô tả bởi Pérez-Miranda và ctv. (2007).
- Thí nghiệm được tiến hành trong đĩa petri (môi trường King’s B), 5 lần lặp lại, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố, 17 chủng vi khuẩn đối kháng, mỗi chủng là một nghiệm thức.
- Nhân mật số vi khuẩn trong môi trường King’s B lỏng trong 36 giờ (mật số khoảng 109 cfu/ml).
- Cấy lên đĩa petri (môi trường King’B) 5 điểm vi khuẩn, mỗi điểm là một vòng kim cấy có chứa vi khuẩn đối kháng. Nuôi vi khuẩn 48 giờ trong đĩa petri đặt trong tủ định ôn ở 300C.
- Chuẩn bị môi trường O-CAS, hút 10 ml môi trường đổ lên mặt môi trường đĩa King’B có chứa vi khuẩn đối kháng.
- 15 phút sau tiến hành ghi nhận sự thay đổi vế màu sắc trên môi trường O-CAS.