- Thời gian: từ tháng 12–2011 đến tháng 04–2011.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinh học NEDO – VIỆT NAM thuộc Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
Các chủng nấm Beauveria thu thập được từ những côn trùng bị nấm ký sinh ngoài tự nhiên được sử dụng để nghiên cứu.
Thiết bị và dụng cụ:
- Nồi thanh trùng ướt (autoclave) hiệu Sanyo, model MLS - 3780 - Tủ thanh trùng khô hiệu MOV – 212F
- Máy lắc hiệu Vortex
- Cân điện tử hiệu Sartorius, Model CP- 224S - Tủ cấy hiệu Sanyo, model MCV-B131F
- Kính hiển vi tương phản pha hiệu Olympus model BX51N-33-PH - Lò vi sóng hiệu National, model MX - 225WF
- Dĩa Petri (đường kính đáy 9,0 cm, nắp 9,5 cm) - Chai thủy tinh nắp xanh chịu nhiệt (Isolab – Đức)
- Lame đếm hồng cầu (Haemocytometer) hiệu Thomas (Nhật) - Micropipette các loại kích cỡ hiệu Nichipet EX (Nhật)
Các vật dụng cần thiết khác Hóa chất:
- Môi trường SDAY3 là môi trường dùng nuôi cấy nấm gồm:
Glucose 40g
Pepton 10g
MgSO4.7H2O 0.5g
KH2PO4 1g
NaNO3 2g
Yeast extract 2g
Agar 20g
Nước cất 1000ml
- Môi trường CDA (Czapek - Dox Agar) gồm:
NaNO3 2g
KH2PO4 1g
MgSO4.7H2O 0,5g
KCl 0,5g
FeSO4.7H2O 0,01g
Sucrose 30g
Agar 20g
Nước cất 1000ml
- Môi trường SDAY1 (Sabouraud Dextrose Agar Yeast) gồm:
Pepton 10g
Dextrose 40g
Yeast extract 2g
Agar 20g
Nước cất 1000ml
- Môi trường SDAY+CHITIN (Sabouraud Dextrose Agar Yeast + Kitin) gồm:
Pepton 2g
Dextrose 20g
Yeast extract 2g
Chitin 5g
Agar 20g
Nước cất 1000ml
2.2 Phương pháp thực hiện
2.2.1 Thí nghiệm 1: Thu thập và định danh nấm trắng Beauveria bassiana thông qua phương pháp truyền thống.
Thu thập những mẫu côn trùng bị nấm ký sinh chết ngoài tự nhiên về phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinh học để phân lập xác định tác nhân.
Nấm được nuôi phân lập trên môi trường PDA. Định danh nấm theo khóa phân loại của Barnett và Barry (1998).
Mẫu nấm được đặt tên theo ký tự: Tên nấm + tên ký chủ + địa điểm thu mẫu và viết tắt bằng chữ cái đầu. Ví dụ: nấm Beauveria bassiana phân lập trên rầy nâu tại Hậu Giang là Bb(RN-HG).
* Các chỉ tiêu theo dõi
- Đặc điểm khuẩn lạc: Cách mọc của sợi nấm, màu sắc khuẩn lạc được quan sát bằng mắt thường vào lúc 7 – 10 ngày sau khi nuôi cấy.
- Đặc điểm cơ quan sinh bào tử, hình dạng bào tử: Cấy bào tử của từng chủng nấm trắng phân lập được theo phương pháp Slide culture có cải tiến. Sau đó quan sát, nhận diện, mô tả và chụp hình dạng bào tử, cành bào đài của các chủng nấm này dưới kính hiển vi tương phản pha.
- Kích thước bào tử: Thực hiện theo phương pháp của Reza và ctv. (2006) đã được cải tiến là các mẫu nấm được nuôi cấy trên môi trường SDAY3 trong 10 ngày đặt ở nhiệt độ 27 ± 20C, sau đó tiến hành thu bào tử trong dung dịch nước cất có bổ sung 0,05% Tween 20. Đo kích thước 2 đường chéo vuông góc của 30 bào tử/chủng nấm dưới kính hiển vi tương phản pha với độ phóng đại 1000 lần.
2.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định thời gian nảy mầm của nấm Beauveria bassiana.
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp Milner và ctv., (1991). Trải đều 0,1 ml huyền phù bào tử của các chủng nấm phân lập được (106 bào tử/ml trong 0,05% Tween 20) trên các lame có phủ một lớp môi trường nuôi cấy SDAY3 đặt ở nhiệt độ 27±20C. Mỗi chủng nấm thực hiện trên 4 lame tương ứng với 4 lần lặp lại. Tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) được đánh giá 4 giờ 1 lần trong vòng 24 giờ dưới kính hiển vi với độ phóng đại 200 lần. Quan sát 4 thị trường/lame, 25 bào tử/thị trường, tổng số bào tử quan sát là 400 cho mỗi chủng nấm.
2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng hình thành bào tử của nấm Beauveria bassiana
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Houping và ctv., (2003).
Dùng 0,1ml huyền phù có chứa bào tử của mỗi chủng nấm (106 bào tử/ml) chà đều lên dĩa petri có chứa môi trường SDAY3. Mỗi chủng nấm được cấy trên 4 đĩa petri tương ứng với 4 lần lập lại và đặt ở nhiệt độ 27±2oC trong 10 ngày. Lấy ngẫu nhiên 2 khoanh nấm (đường kính 10 mm) cho vào 5 ml dung dịch nước cất thanh trùng có chứa 0,05% Tween 20 để trên máy lắc vortex trong 10 phút để tách bào tử. Số lượng bào tử trên/ml của 1 cm2 môi trường nuôi cấy có chứa bào tử nấm được xác định bằng lame đếm hồng cầu hiệu Thomas và tính theo công thức:
Y = 4 x 106 x a x b Trong đó: Y: mật số bào tử (bt/ml)
a: số bào tử nấm trong ô đếm nhỏ nhất
b: hệ số pha loãng
Mật số bào tử/cm2 = Y/diện tích khuẩn lạc Kunimi và Nakai (2001)
2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của các chủng nấm Beauveria bassiana
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Kamp và Bidochka (2002) với hai nhân tố, trong đó nhân tố A là các chủng nấm trắng phân lập được, nhân tố B là bốn loại môi trường nuôi cấy khác nhau như CDA, SDAY1, SDAY3 và SDAY+CHITIN với 4 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại sử dụng 1 đĩa petri có chứa 10 ml môi trường cần khảo sát. Sau đó cấy 1 khoanh nấm có đường kính 7 mm vào giữa đĩa môi trường và đặt ở nhiệt độ 29 ± 2oC trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Sự phát triển của khuẩn lạc được quan sát bằng cách đo 2 đường kính vuông góc trên 2 trục của khuẩn lạc, sau đó đường kính khuẩn lạc được tính theo công thức:
d = (d1+d2)/2
Trong đó: d1 và d2 là độ dài hai đường chéo phần khuẩn lạc phân bố
Chỉ tiêu được ghi nhận vào các ngày 5, 7, 9, 11, 13, 15, ……., 31 ngày sau khi nuôi cấy.
- Tốc độ phát triển trung bình (cm/ngày): trung bình của 3 lần đo đường kính khuẩn lạc từ 5-7, 7-9 và 9-11 ngày sau khi cấy.
CHƯƠNG III