CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Xác định phần trăm chất chiết được trong dược liệu theo DĐVN IV 3.5.1.1. Theo DĐVN IV
Cân chính xác khoảng 4,000 g bột dược liệu có cỡ bột nửa thô cho vào bình nón 250 ml. Thêm chính xác 100,0 ml ethanol 30 %, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ, sau đó đun cách thủy dưới hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng ethanol 30 % để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô, cắn thu được sấy ở 105 oC trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn. Tính phần trăm lượng chất chiết được bằng nước theo dược liệu khô.
3.5.1.2. Theo dung môi sử dụng
Cân chính xác khoảng 4,000 g bột dược liệu có cỡ bột thô cho vào bình nón 250 ml.
Thêm chính xác 100,0 ml dung môi, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ, sau đó đun cách thủy dưới hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng dung môi để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô, cắn thu được sấy ở 105 oC trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn. Tính phần trăm lượng chất chiết được bằng nước theo dược liệu khô.
(Dược điển Việt Nam IV, 2009).
3.5.2. Điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ
3.5.2.1. Lựa chọn dung môi và phương pháp chiết
Lựa chọn dung môi chiết dựa trên kết quả chấm sắc ký lớp mỏng:
34
Cân khoảng 20 g dược liệu khô cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm dung môi vừa ngập mặt dược liệu. Đun bình nón ở 60 oC trong 45 phút. Lọc qua bông. Lấy 20 ml dịch lọc thu được đem cô trên bếp cách thủy còn khoảng 1 ml. Dịch lọc sau khi cô đem chấm sắc ký trên bản mỏng silicagel F254.
Dung môi chiết được sử dụng để thử nghiệm là nước, ethanol 20 % và ethanol 40 %.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng(SKLM):
- Bản mỏng: Silica gel G đã hoạt hóa ở 110 oC trong 1 giờ
- Dung môi khai triển: Ethylacetat – methanol – nước (100 : 17 : 13)
- Dung dịch thử: Lấy 0,25 g bột dược liệu đun cách thủy với 20 ml ethanol 96 % (TT) trong 30 phút, để nguội, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Cắn thêm vào 10 ml nước và 1 ml dung dịch acid hydrocloric 10 % (TT) đun cách thủy 30 phút, để nguội sau đó lắc với 20 ml ether ethylic (TT) 2 lần, dịch ether được bay hơi con khoảng 1 ml dùng làm dung dịch thử.
- Dung dịch đối chiếu: Pha dung dịch emodin 0,1 % trong ethanol 96 % (TT). Nếu không có các chất đối chiếu, dùng 0,25 g bột Hà thủ ô đỏ (mẫu chuẩn), chiết như dung dịch thử.
- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai, để khô bản mỏng trong không khí ở nhiệt độ phòng, phát hiện các vết dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm và hơi amoniac. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (Dược điển Việt Nam IV, 2009)
Từ kết quả của việc khảo sát dung môi chiết, lựa chọn phương pháp chiết xuất dược liệu phù hợp. Một số phương pháp chiết xuất được đề nghị phù hợp với hai loại dung môi khảo sát nước và ethanol thấp độ là: Hầm, sắc, phương pháp ngấm kiệt – ngâm nhỏ giọt.
3.5.2.2. Lựa chọn tá dược điều chế cao khô
Dựa theo kỹ thuật chung điều chế cao khô (Dược điển Việt Nam IV, 2009), tiến hành điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ theo sơ đồ sau:
Dược liệu
Dược liệu đã xử lý Ethanol 40 %
chia thô
làm ẩm ngâm lạnh 24 giờ
35
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình điều chế cao khô
Cách tiến hành: Cân khoảng 200 g dược liệu khô có cỡ bột thô cho vào bercher 1.000 ml, thêm ethanol 40 % vừa ngập mặt dược liệu. Để yên bercher 1 giờ để dược liệu nở đều.Cho dược liệu đã làm ẩm vào bình ngấm kiệt, gạt bằng mặt, không nén chặt. Thêm ethanol 40 % ngập mặt dược liệu 2– 4 cm, ngâm lạnh 24 giờ. Rút dịch chiết với tốc độ 1– 3 ml/phút. Vừa rút dịch chiết vừa thêm dung môi để luôn tạo một lớp dung môi trên bề mặt khối dược liệu. Tổng lượng dung môi sử dụng bằng 9 lần dược liệu. Cô toàn bộ dịch chiết trên bếp cách thủy, nhiệt độ không quá 70 oC, đến khi thu được khối cao đặc sệt khoảng 70 g.
Tá dược lactose, tinh bột bắp, tinh bột mì sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 oC trong 2 giờ.Cân vào chén sứ chính xác khoảng 6 g cao đặc.Trộn đều cao đặc với tá dược thành khối dẻo, chia nhỏ, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 oC trong 48 giờ.
Bảng 3.3. Tỷ lệ tá dược điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ
Lactose Tinh bột lúa mì Tinh bột bắp Khối lượng tá dược
Mẫu 1 30 % 1,8 g
Mẫu 2 40 % 2,4 g
Mẫu 3 50 % 3,0 g
36
Mẫu 4 30 % 1,8 g
Mẫu 5 40 % 2,4 g
Mẫu 6 50 % 3,0 g
Mẫu 7 30 % 1,8 g
Mẫu 8 40 % 2,4 g
Mẫu 9 50 % 3,0 g
Mỗi mẫu tá dược thực hiện3 lần, lấy kết quả trung bình. Dựa vào kết quả độ ẩm chọn loại tá dược phối hợp để chế thành cao khô.
Kiểm soátmột số tính chất của cao khô:
- Cảm quan
- Độ ẩm (xác định bằng máy sấy ẩm hồng ngoại Ohaus): Cân khối lượng cao khô khoảng 3 g cho nhẹ nhàng vào khây, trải đều thành lớp mỏng với độ dày không quá 2 mm. Ghi nhận độ ẩm của cao khô sau khi máy ngừng hoạt động.Mỗi mẫu thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình. Tiến hành với 3 mẫu.
- Phương pháp sắc SKLM: Dùng mẫu cao khô đã sấy chấm sắc ký lớp mỏng kiểm tra ảnh hưởng của tá dược với dịch chiết Hà thủ ô đỏ ban đầu.
3.5.3. Điều chế viên nén Hà thủ ô đỏ
3.5.3.1. Nghiên cứu công thức bào chế viên nén
Dựa vào khối lượng dược liệu sử dụng cho một ngày là 6 – 12 g (Dược điểnViệt Nam IV, 2009)và khối lượng chất chiết được từ dược liệu từ đó suy ra lượng cao khô cần sử dụng cho một ngày và khối lượng của viên nén.
Cỡ lô nghiên cứu 2000 viên cho 3 công thức.
Bảng 3.4.Công thức bào chế viên nén Hà thủ ô đỏ
Thành phần Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3
Cao khô Hà thủ ô đỏ 70,0 % 70,0 % 70,0 %
Avicel 101 25,0 % 19,0 % 22,0 %
Sodium starch glycolat 2,0 % 8,0 % 5,0 %
Aerosil 1,0 % 1,0 % 1,0 %
Mg stearat 1,0 % 1,0 % 1,0 %
Talc 1,0 % 1,0 % 1,0 %
trộn 5 phút trộn 5 phút
trộn 5 phút Cao khô Hà thủ ô đỏ
(nghiền, rây)
Aerosil
Cốm A DST + Avicel
Cốm B Talc + Mg
stearat
37
Hình 3.2.Sơ đồ qui trình bào chế viên nén Hà thủ ô đỏ
3.5.3.2. Kiểm soát bán thành phẩm Bột hoàn tất:
- Tính chất.
- Độ ẩm (xác định bằng máy sấy ẩm hồng ngoại Ohaus): Tiến hành tương tự như kiểm soát độ ẩm của cao khô. Mỗi mẫu thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình. Tiến hành với 3 mẫu.
- Định tính: Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng:
Bản mỏng: Silica gel G đã hoạt hóa ở 110 oC trong 1 giờ
Dung môi khai triển: Ethylacetat – methanol – nước (100 : 17 : 13)
Dung dịch thử: Lấy một khối lượng bột hoàn tất tương ứng 0,25 g bột dược liệu đun cách thủy với 20 ml ethanol 96 % (TT) trong 30 phút, để nguội, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Cắn thêm vào 10 ml nước và 1 ml dung dịch acid hydrocloric 10 % (TT) đun cách thủy 30 phút, để nguội sau đó lắc với 20 ml ether ethylic (TT) 2 lần, dịch ether được bay hơi con khoảng 1 ml dùng làm dung dịch thử.
Dung dịch đối chiếu: Dùng 0,25 g bột Hà thủ ô đỏ (mẫu thử), chiết như dung dịch thử.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai, để khô bản mỏng trong không khí ở nhiệt độ phòng, phát hiện các vết dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm và hơi amoniac. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
3.5.3.3. Kiểm soát thành phẩm viên nén
Độ đồng đều khối lượng viên nén: Cân 20 đơn vị bất kỳ, tính khối lượng trung bình, cân riêng khối lượng từng đơn vị. Mẫu thử đạt tiêu chuẩn khi không quá 2 đơn vị có
38
khối lượng nằm ngoài khoảng m ± độ lệch cho phép và không có viên nào chênh lệch quá m ± 2xđộ lệch.
Độ rã: Cho vào 6 ống thử mỗi ống một viên nén, cho tiếp vào mỗi ống đĩa nhựa đậy lên trên. Treo giá đỡ ống thử trong cốc 1.000 ml có chứa 800 ml nước cất. Ghi nhận thời gian của từng viên nén rã hoàn toàn. Mẫu thử được coi là đạt yêu cầu về độ rã khi không còn cặn, nếu có cặn còn lại thì nó chỉ là một khối mềm không được có nhân khô rắn sờ thấy được. Mẫu thử đạt yêu cầu khi 6 viên đều phải rã hoàn toàn trong thời gian không quá 15 phút.
Định tính: Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Tiến hành tương tự cách định tính bột hoàn tất:
-Dung dịch thử: Lấy 20 viên nén nghiền mịn, cân một lượng cốm tương ứng 0,25 g bột dược liệu đun cách thủy với 20 ml ethanol 96 % (TT) trong 30 phút, để nguội, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Cắn thêm vào 10 ml nước và 1 ml dung dịch acid hydrocloric 10
% (TT) đun cách thủy 30 phút, để nguội sau đó lắc với 20 ml ether ethylic (TT) 2 lần, dịch ether được bay hơi con khoảng 1 ml dùng làm dung dịch thử.
- Dung dịch đối chiếu: Dùng 0,25 g bột Hà thủ ô đỏ (mẫu thử), chiết như dung dịchdung dịch thử.