ðỊ Að IỂM, ðỐ IT ƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2.7Phương pháp làm tiêu bản vi thể ñượ c thực hiện theo quy trình tẩm
ựúc bằng Parafin, nhuộm Haematoxylin Ờ Eosin (HE).
* Cốựịnh bệnh phẩm: (Mục ựắch ựể giết chết tổ chức)
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (bệnh phẩm phải ngập trong formol), ựể sau 10 ngày là có thể sử dụng ựược.
* Vùi bệnh phẩm: (Tạo ra chất nền cho tổ chức dễ cắt) Tiến hành lần lượt các bước sau:
- Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình ngâm mẫu, cắt thành các miếng tổ chức theo chiều dài có ựộ dài 4 Ờ 5 mm. Cho vào khuôn ựúc bằng nhựa,
- Khử nước và khử cồn: Khử nước Cồn 900I : 14 giờ Khử cồn Cồn 900II : 1 giờ Xylen 1: 2,5 giờ Cồn 1000I : 1 giờ Xylen 2: 1giờ Cồn 1000II : 1 giờ Xylen 3: 1 giờ Cồn 1000III : 3,5 giờ Mục ựắch ựể khử hết nước và khử hết cồn ra khỏi tổ chức.
Yêu cầu: Khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là ựược. Nếu ựể
quá lâu thì miếng tổ chức sẽ ròn, dễ vỡ và khó cắt.
- Khử Xylen: Cho qua hệ thống parafin ựã ổn ựịnh (parafin có từ
3-5% sáp ong ựã nấu, ựảo nhiều lần thành một môi trường ựồng nhất, ổn ựịnh,
ựặc, chắc, không lẫn tạp chất). Gồm 4 lọ:
Lọ 1: Parafin + Xylen với tỷ lệ 1:1 (ở 370C) : 14 giờ
Lọ 2: Parafin I (ở 560C) : 3 giờ
Lọ 3: Parafin II (ở 560C) : 3 giờ
Lọ 4: Parafin III (ở 560C) : 3 giờ
Mục ựắch: để khử hết Xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ còn Parafin thấm ựều trong các kẽ mô bào.
* đúc Block:
Mục ựắch: để vùi miếng tổ chức trong môi trường Parafin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
Tiến hành:
- đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chắnh giữa khuôn block và ựổ nhanh parafin lỏng vào block. Sau ựó ựặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội từ từ ựến khi ựông cứng, ựặc và chắc là ựược.
- Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn rồi gắn nhãn ựể tránh nhầm lẫn.
* Cắt dán mảnh:
Cắt mảnh bằng máy Microtom với ựộ dàn mảnh cắt khoảng 3 Ờ 5 ộm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức là ựược.
Tãi mảnh: Sau khi cắt ựược, dùng pank kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh sau ựó dùng phiến kắnh trong, sáng, không xước, hớt mảnh cắt cho sang nước
ấm 480C rồi lấy kắnh với mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. Sau ựó ựể tủấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô là ựược.
* Nhuộm tiêu bản: Gồm các bước:
+ Bước 1: Khử parafin : Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I : 3 Ờ 5 phút Xylen II : 3 Ờ 5 phút Xylen III : 3 Ờ 5 phút + Bước 2: Khử Xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ:
Cồn 1000 2 lần (mỗi lần 1 phút) Lọ 3: Cồn 700 : 1 lần Lọ 2: Cồn 900 : 1 lần Lọ 4: Cồn 500 : 1 lần + Bước 3: Khử cồn: để tiêu bản dưới vòi nước chảy trong 15 phút. + Bước 4: Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi nước, lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ
Haematoxylin ngập tiêu bản. để trong vòng 8 Ờ 10 phút, sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa qua nước chảy 3 Ờ 5 phút cho hết Haematoxylin thừa. đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô ựi. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tắm là ựược.
Nếu nhạt màu thì phải nhúng tiêu bản qua lọ NaHCO3 1% (30 giây) Nếu màu ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + HCl) trong 30 giây. Sau khi ựiều chỉnh màu ta rửa sạch tiêu bản bằng nước cất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Bước 5: Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Eosin. Sau ựó rửa dưới vòi nước chảy khoảng 3 Ờ 5 phút cho hết Eosin thừa. + Bước 6: Tẩy nước: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ:
Lọ 1: Cồn 700 trong 15 giây Lọ 3: Cồn 1000 I trong 15 giây Lọ 2: Cồn 900 trong 15 giây Lọ 4: Cồn 1000II trong 15 giây + Bước 7: Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua lọựựng Xylen I trong thời gian 1 Ờ 2 phút sau ựó ựưa qua lọ Xylen II (ựể trong tủấm 370C) trong 2 phút.
+ Bước 8: Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹựể dồn hết bọt khắ ra ngoài.
đánh giá: đem soi lên kắnh hiển vi quang học với vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.
* Xác ựịnh chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu
Phương pháp ựếm hồng cầu, bạch cầu bằng buồng ựếm Newbauer: Chuẩn bị: Buồng ựếm hồng Ờ bạch cầu Newbauer, ống pha loãng hồng bạch cầu, kắnh hiển vi quang học, lamen, bông, cồn.
Dung dịch pha loãng hồng bạch cầu (chung cho cả ựếm hồng cầu và bạch cầu) là một dung dịch ựẳng trương và chứa các chất không kết dắnh hồng cầu, Có thể dùng các dung dịch sau:
+ Dung dịch Hayem: NaCl (1g), Na2SO4 (5g), HgCl2 (0,5g), nước cất. + Dung dịch nước muối sinh lý NaCl (9g), nước cất (1000ml).
* đếm hồng cầu
- Hút máu vào ống pha loãng ựến vạch 0,5, cột máu liên tục không lẫn bọt khắ, dùng bông lau sạch bên ngoài và ựầu ống hút.
- Hút tiếp dung dịch pha loãng vừa ựủựến vạch 101.
sau ựó ựảo nhẹ theo ựộng tác số 8 ắt nhất 1 phút cho máu ựược trộn ựều. - đậy lamen lên buồng ựếm, ựưa buồng ựếm lên kắnh hiển vi dùng thị
kắnh 10 và vật kắnh 10 ựiều chỉnh ựể tìm ô ựếm.
- Lắc lại ống hút sau ựó nhỏ dung dịch máu ựã pha vào khe buồng ựếm
ựể cho dung dịch máu theo mao dẫn sẽ lan khắp ô ựếm (trước khi nhỏ phải bỏ ựi 1 Ờ 2 giọt ựầu). đợi 2 Ờ 3 phút sau cho hồng cầu ổn ựịnh, ta bắt ựầu ựếm.
Cách ựếm: đếm 5 ô trung bình, mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ ở 4 vị trắ góc và chắnh giữa. Khi ựếm ta ựếm lần lượt theo hình chữ chi (chữ Z), chỉ ựếm những hồng cầu nằm gọn phắa trong, nằm trên cạnh trên và cạnh bên phải ô nhỏ.
Cách tắnh: Gọi M là tổng số hồng cầu ựếm ựược ở 5 ô trung bình thì số
hồng cầu trong 1 mm3 là M x 10.000.
* đếm bạch cầu
- Hút máu vào ống pha loãng ựến vạch 0,5
- Hút dung dịch pha loãng ựến vạch 11, cách trộn và ựếm thao tác như ựếm hồng cầu.
Cách tắnh: Gọi số bạch cầu ựếm ựược trong 4 ô là N thì số lượng bạch cầu có trong 1 mm3 là N x 2000.
Phương pháp làm huyết sắc tố Shalli
Nguyên tắc: Cho acid HCl vào máu sẽ kết hợp với huyết sắc tố tạo thành Hematin màu nâu, sau ựó so màu với ống chuẩn,
Thuốc thử: HCl 0,1N hoặc 1%.
Thao tác: Cho dung dịch HCl 0,1N vào ống ựến vạch 10. Dùng máu hút
ựến vạch 20. Dùng bông lau sạch những vết máu ngoài ống. Cho ống hút xuống tận ựáy ống ựo thổi nhẹ máu xuống ống hút và hút lên thổi xuống nhiều lần ựể rửa sạch máu trong ống hút rồi trộn ựều.
và máu của ống chuẩn bằng nhau thì thôi. đọc kết quả trên cột số, ựó là số (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gam huyết sắc tố trong 100ml máu.
Chú ý: Nếu pha loãng dung dịch quá sớm, kết quả ựịnh lượng sẽ sai. Nếu cho máu vào chỉ 1 phút sau pha loãng, kết quả chỉ bằng 75% so với thực tế vì chỉ có 75% huyết sắc tố chuyển thành Hematin, nếu 5 phút sau pha loãng thì có 88% và 2 giờ sau là 100%. Sau 10 phút pha loãng chỉ có 90% lượng huyết sắc tố chuyển thành màu nâu. Những ống mẫu của bộ huyết sắc kế
Shalli ựã ựược pha trong ựiều kiện ựó.
Sau mỗi lần ựo phải rửa sạch bằng nước cất.
đơn vị tắnh: %.
Phương pháp Hematocrit
Dụng cụ: Máy ly tâm TH Ờ 12, ống ly tâm, thước ựọc kết quả, sáp ong bịt ống ly tâm.
Cách làm: Lấy máu chống ựông vào ống Hematocrit sao cho lượng máu hút vào phải ựều nhau và không có lẫn bọt khắ ở trong, bịt kắn một ựầu
ống bằng sáp ong khoảng 1- 2 mm ựem ựặt vào máy ly tâm sao cho ựối xứng nhau ựặt các ựầu bịt sáp ong hướng ra ngoài), ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút trong vòng 10 Ờ 15 phút. Sau ựó lấy ra ựọc kết quả.
đơn vị tắnh: ộm3.
Thể tắch bình quân hồng cầu: được tắnh theo công thức sau:
Lượng huyết sắc tố (Hemoglobin) bình quân hồng cầu: (LHbBQ)
Biểu thị lượng huyết sắc tố trong mỗi hồng cầu, ựược tắnh theo công thức:
Nồng ựộ huyết sắc tố bình quân hồng cầu: (NđHbBQ)
Biểu thị tỷ lệ % huyết sắc tố chứa trong 100ml hồng cầu hoặc tỷ lệ % huyết sắc tố so với thể tắch mỗi hồng cầu.