Phân tích định tính và định lượng của curcuminoids trong mẫu bột nghệ là rất quan trọng để xác định chất lượng của nguyên liệu, thành phẩm của chúng.
1.5.1. Các phương pháp quang phổ - Phổ UV-Vis
Các phương pháp tiêu chuẩn để xác định curcuminoids hoặc các sản phẩm dựa trên Curcuma là phổ UV-Vis là dựa trên các phép đo trực tiếp của mẫu trong các dung môi nào đó. Trong một số dung môi hữu cơ, curcuminoids có cường độ hấp thụ tại bước sóng 420-430 nm. Tuy nhiên, do sự có mặt của các chất khác có nhóm hấp thụ tại bước sóng này sẽ ảnh hưởng đến độ chính xác của các kết quả [31]. Định lượng curcuminoid sử dụng kỹ thuật quang phổ UV-Vis thường được thể hiện như là tổng hàm lượng curcuminoids. Pothitirat và Gritsanapan [43] xác định các hàm lượng curcuminoids trong nghệ thu được ở Thái Lan, được đo ở 420 nm. Đường chuẩn được xây dựng ở các nồng độ là 0,8; 1,6; 2,0; 2,4 và 3,2 mg/ml. Để chuẩn bị mẫu, bột curcumin được thêm tetrahydrofuran và pha loãng trong MeOH.
Ủy ban Hỗn hợp chuyên gia về phụ gia thực phẩm (2001) đã xác định rằng chất curcumin xác định bằng quang phổ UV-Vis trong etanol tại λ = 425 nm. Vì lý do này, một số ngành công nghiệp chấp nhận điều này làm giá trị tham chiếu cho cùng ba loại curcuminoids. Tuy nhiên, một số giá trị cho các bước sóng cực đại (λmax) khác nhau có thể cũng nêu trong tài liệu. Ủy ban châu Âu (EC) đã được chỉ định sử dụng λ = 426 nm, trong khi cơ quan quản lý khác nêu λmax giữa 424 và 430 nm. Sự khác biệt này xuất phát từ tỷ lệ của mỗi curcuminoids trong hỗn hợp, bởi vì mỗi một chất thể hiện bước sóng cực đại khác nhau. Với curcumin (Cur) trong etanol có λmax ở 430 nm, trong khi đó demetoxycurcumin (DMC) và bis- demetoxycurcumin (BDMC) thể hiện λmax là 423 và 418 nm. Do đó, sự phân bố này ảnh hưởng đến giá trị trung bình của λ trong hỗn hợp.
- Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại, đặc biệt là khi kết hợp với kỹ thuật chemometrics, được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng Curcumin trong thực phẩm, nông nghiệp, và các sản phẩm dược phẩm [53]. Phương pháp này cho phép phân tích nhanh và nhạy, dễ dàng trong việc chuẩn bị mẫu, với kỹ thuật không phá mẫu, có nghĩa là các mẫu sử dụng có thể được sử dụng để phân tích thêm.
Tanaka và cộng sự đã nghiên cứu khả năng phổ hồng ngoại gần (NIR) để định lượng hàm lượng của curcuminoids (Cur, DMC, và BDMC) trong củ nghệ.
Kết hợp sử dụng xử lý hàm bậc hai và tiêu chuẩn ngẫu nhiên, hiệu chỉnh diện tích nhỏ nhất từng phần là sử dụng các vùng phổ ở 1500-2500 nm và 1850-2040 nm để định lượng riêng và tổng curcuminoids. Kết quả cho thấy các phương pháp tối ưu hóa cung cấp mô hình dự đoán tốt với sai số chuẩn của các dự đoán là 0,117; 0,061;
0,070 và 0,174%, tương ứng với Cur, DMC, BDMC và tổng curcuminoids [61].
1.5.2. Phương pháp phân tích dòng chảy (FIA)
Hệ thống FIA với phát hiện trực tiếp bằng cách sử dụng tia cực tím (UV) ở 250 nm và fluorometric (FL) sử dụng λex = 397 nm và 508 nm FIA được phát triển để phân tích các curcuminoids trong củ nghệ [29]. FIA đã được tiến hành ở nhiệt độ môi trường bằng cách sử dụng các dung môi hữu cơ khác nhau, hoặc một mình hoặc kết hợp với nước làm dung dịch vận chuyển với tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút.
Giới hạn phát hiện nhận được khi sử dụng FL (2,0 mg/ml) là tốt hơn so với UV (30,0 mg/ml). Các giá trị r thu được là cao hơn 0,99. Các tác giả cho rằng phương pháp phát triển có thể được áp dụng cho một phân tích định kỳ cho curcuminoids tại một khoảng ước lượng bằng việc sử dụng chất curcumin chuẩn.
Một quy trình phân tích đơn giản bằng cách sử dụng FIA cũng đã được đề xuất bởi Thongchai và cộng sự [63] cho việc định lượng curcuminoids trong chiết
xuất nghệ, dựa trên sự phát triển của phức màu giữa curcuminoids và 4-aminoatipyrin, trong sự có mặt của các tác nhân oxy hóa như kali hexacyano sắt
(III). Tổng hàm lượng của curcuminoids có thể được đánh giá trong khoảng nồng độ là 5-50 ppm, độ nhạy và giới hạn phát hiện tương ứng là 0,6 và 1,8 ppm. Độ
chính xác bằng cách sử dụng tham số độ lệch chuẩn cho khả năng lặp lại nhỏ hơn 2,0% với độ phục hồi là 94,3-108,0%.
1.5.3. Phương pháp sắc ký
Các phương pháp sắc ký là kỹ thuật phân tích đang nổi lên trong phân tích hóa học, phù hợp với định tính và định lượng một số lượng lớn các mẫu. Bên cạnh đó, các kỹ thuật này cũng cho phép phân tách các chất phân tích quan tâm trong thành phần và phân tích đồng thời một số chất trong mẫu [23].
Do đặc tính có lợi như chi phí thấp, dễ dàng trong việc chuẩn bị mẫu, sắc ký lớp mỏng (TLC) thường được sử dụng cho các mục đích nhận dạng, tách, định lượng hoặc bán định lượng các chất màu tự nhiên bao gồm curcuminoids [28]. Tuy nhiên, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp được lựa chọn cho phân tích curcuminoids vì độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp của nó.
- Sắc ký bản mỏng
Anderson và cộng sự [12] đã phân lập curcuminoids từ củ nghệ bằng sử dụng tấm silica. Việc chiết tách củ nghệ đã được thực hiện bằng diclometan với sự trợ giúp của máy khuấy từ và nhiệt hồi lưu trong 60 phút. Dịch chiết được lọc và cô đặc trong bồn nước ở 50oC, và cặn thu được tiếp tục rửa giải trong hexan. Tấm silica được hiện ảnh ba lần bằng diclometan-MeOH (99: 1 về thể tích). Giá trị Rf thu được cho curcumin là 0,52.
Khả năng hai chiều TLC để phân tích về ba curcuminoids trong thân rễ của C. phaeocaulis, C. kwangsiensis, C. wenyujin và C. longa đã được nghiên cứu bởi Zhang [76]. Việc tách sắc ký đã đạt được trên tấm gel silica 60F254 với hỗn hợp dung dịch rửa giải của CHCl3-MeOH-HCOOH (tỷ lệ thể tích là 20: 1: 0,2) và dầu ete-etyl axetat (tỷ lệ thể tích là 9: 1) cho hai lần phát triển. Các đốm sắc ký đồ là màu sử dụng 1% vanillin trong axit sulfuric. Sự có mặt của curcuminoids trong các cây này là bán định lượng tại λ quét và λ tham khảo ở 518 và 800 nm.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là phương pháp thường dùng nhất cho phân tích curcuminoids do tính linh hoạt và dễ dàng trong sử dụng. Trong hầu hết các trường hợp, các phương pháp
HPLC sử dụng detector quang phổ UV-Vis hoặc photodiode-array detector (PDA) tại λ ở 260 hoặc 450 nm được sử dụng, vì những kỹ thuật này đòi hỏi thiết bị đo đạc đơn giản và đủ để xác định curcuminoids trong một số sản phẩm.
Bos và cộng sự [19] đã sử dụng HPLC sử dụng detector PDA tại 425 nm để phân tích curcuminoids ở một số chi Curcuma ở Indonesia, cụ thể là C. Mangga Val
&. v. Zijp, C. heyneana Val. & V.Zijp, C. aeruginosa Roxb. và C. soloensis Val. Sự tách biệt đã đạt được bằng cách sử dụng Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 × 4,6 mm;
5 μm) với pha động gồm một hỗn hợp của MeOH-H2O (có chứa 0,1% axit trifloaxetic) -axetonitril (tỷ lệ thể tích là 39,5: 350: 468). Các phương pháp phát triển cho tính chính xác là 100,4 ± 0,922% (Cur), 99,8 ± 0,806% (DMC), và 99,9 ± 0,574% (BDMC), với giới hạn phát hiện là 0,044 mg cho C; 0,048 mg cho DMC và 0,058 mg cho BDMC.
Nghiên cứu gần đây liên quan đến việc áp dụng HPLC để xác định curcuminoids trong các mẫu thực phẩm thương mại tại Hàn Quốc như cà ri, mù tạt, bánh kẹo, dưa và các loại thực phẩm ăn nhẹ được thực hiện bởi Lee và cộng sự [39]. Cột X Terra MS C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) đã được sử dụng để tách. Pha động gồm có 2% CH3COOH trong nước (A) và 2% CH3COOH trong ACN (B).
Việc gradient rửa giải là: 10% B (0-3 phút), 20% B (8 phút), 25% B (13 phút), 35%
B (18 phút) và sau đó được nắm giữ trong 10 phút trước khi trở lại điều kiện ban đầu. Các chất phân tích được phát hiện bằng cách sử dụng PDA tại 420 nm.
Do tính chất huỳnh quang của curcuminoids, detector phổ huỳnh quang có thể được sử dụng để phát hiện sự có mặt của curcuminods. Độ nhạy của máy gấp 10 lần so với quang phổ UV-Vis. Zhang và cộng sự [77] đã phát triển HPLC với huỳnh quang để xác định curcuminoids ở một số chi Curcuma sử dụng 2,5-xylenol như làm tiêu chuẩn. Các λmax cho 2,5-xylenol là 287 nm (kích thích) và 303 nm (phát xạ), trong khi đó đối với các curcuminoids, λmax được sử dụng là 426 nm (kích thích) và 539 nm (phát xạ). Việc tách chất curcuminoids đã đạt được trong vòng 30 phút sử dụng cột Cadenza CD-C18 (250 x 4,6 mm; 3 mm) bằng sử dụng pha động
là hỗn hợp của 0,1 M đệm axetat (pH=4,0) - ACN (tỷ lệ thể tích là 57:43). Báo cáo thời gian lưu của BDMC, DMC và Cur tương ứng là 19, 22, 25 phút.
Bên cạnh đó để phân tích định lượng, HPLC liên quan đến tốc độ cao sắc ký dòng ngược (CCC) bằng cách sử dụng một hệ dung môi hai giai đoạn đơn giản gồm n-hexan/CHCl3/ MeOH/H2O (tỷ lệ thể tích là 2/4/3/1) và pH-zone tinh chế CCC sử dụng metyl-tert-butyl ete/ACN/H2O (tỷ lệ thể tích là 4:1:5) cũng được dùng cho việc tách và tinh chế curcuminoids thành các thành phần riêng lẻ .
1.5.4. Điện di mao quản
Điện di mao quản (CE) là một phương pháp phân tách mạnh, đã nhanh chóng phát triển và được áp dụng rộng rãi để phân tích về dược phẩm và các thành phần thực vật có hoạt tính sinh học. Một số yếu tố như chuẩn bị mẫu, khả năng phân tách và mức phát hiện được đưa vào tính toán khi phân tích các curcuminoids [42].
- Điện di mao quản vùng (CZE)
Trong số các phương thức khác nhau của CE, CZE là phương pháp thường được sử dụng bởi vì nó có chế độ CE đơn giản và linh hoạt nhất [54]. Mức độ curcumin từ phân lập củ nghệ của Trung Quốc đã được xác định bằng cách sử dụng CZE với detector amperometric bởi Sun và cộng sự [59]. Mẫu được chuẩn bị bằng cách sử dụng chiết pha rắn với nhựa tributyl phosphate làm chất hấp thụ. Sử dụng các thông số tối ưu, đệm phosphat 0,015 M ở pH = 9,7 như bộ đệm chạy, điện áp tách ở 16 kV, phun trong 6 giây ở 9 kV và đầu dò ở 1,20 V, giới hạn phát hiện thu được là 3 x10-8 M ở khoảng nồng độ tuyến tính là 7 x 10-4÷ 3x10-6 M (r = 0,9986) cho curcumin chiết xuất từ dầu nhẹ. Độ hồi phục nhận được là 80%. Với độ nhạy cao và chọn lọc của phương pháp, vết của curcumin trong mẫu phức tạp như bột cà ri, các sản phẩm thảo dược, hoặc chất dịch cơ thể có thể được phân tích.
Curcuminoids từ C.domestica Val., C. longa L. và C. xanthorrhiza Roxb. đã được tách thành công và định lượng bằng phương pháp CZE với mao quản silica tiêu chuẩn và PDA ở 258 nm (với tiêu chuẩn định lượng là axit 3,4-dimetoxy-trans- cinnamic) và 470 nm (cho curcuminoids) dưới 5 phút. Một dung dịch điện phân phosphat 20 mM, NaOH 50 mM và β-cyclodextrin 14 mM được cho là phù hợp để
phân tích. LOD thu được là 10 ppm. Các kết quả phân tích được so sánh với phương pháp trắc quang định lượng trong Dược điển Châu Âu. CZE sử dụng dung dịch đệm natri tetraborat 15 mM chứa 10% MeOH ở pH = 10.8, điện áp 25 kV và 30 °C đã được áp dụng thành công để tách và định lượng các curcuminoids trong 7 phút bằng cách sử dụng PDA ở 262 nm với độ chọn lọc tốt [72].
- Sắc ký điện động học mixen (MEKC)
Trong phương pháp này, một pha giả-dừng được tạo thành bằng cách thêm một mixen ion hoạt động bề mặt như natri dodecyl sulfat (SDS) hoặc amoni cetyltrimetyl bromua. Việc tách các chất phân tích trong MEKC dựa vào sự tương tác kỵ nước của các phân tử chất phân tích với pha giả-dừng [68].
Watanabe và cộng sự [73] đã phát triển MEKC cho việc xác định curcuminoids trong một số mẫu bột nghệ. Dựa vào việc lựa chọn dung môi, etanol là dung môi tốt nhất để tách curcuminoids. Sự phân tách đã đạt được bằng cách sử dụng copolyme muối natri của butyl acrylat- butyl metacrylat-metacrylic axit chứa 50% dimetyl sulfoxid. Các đường cong chuẩn tuyến tính trong khoảng 6,25-100 mg/ml với hệ số tương quan là 0,999. Giới hạn phát hiện thu được là 0,1 μg /ml.
Tóm lại, trong các phương pháp phân tích đã được báo cáo ở trên về phân tích định lượng curcuminoids bằng các kỹ thuật dựa trên sắc ký và điện di là một trong những phương pháp tốt để xác định curcuminoids và phân tách riêng rẽ. Còn phương pháp dựa vào quang phổ, biểu diễn tổng số hàm lượng curcuminoids trong mẫu. Kỹ thuật này không thể tách và định lượng các curcuminoids riêng rẽ [30].
Tuy nhiên, kỹ thuật quang phổ vẫn rất có ý nghĩa trong phân tích định lượng bằng phương pháp xử lý số liệu.