Đánh giá phương pháp phân tích

3.2. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng curcumin

3.2.3. Đánh giá phương pháp phân tích

Từ kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho phép đo phổ UV-Vis của Cur và Fe3O4 – CS – Cur, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn để xác định curcumin bằng phương pháp UV-Vis.

* Đường chuẩn của Curcumin

Với việc khảo sát độ hấp thụ quang của Cur theo nồng độ, chúng tôi thu được kết quả số liệu trong bảng 3.8 và hình 3.11:

Bảng 3.8: Mối tương quan giữa nồng độ Cur và độ hấp thụ quang Nồng độ Cur

(mg/l)

Độ hấp thụ quang

Nồng độ Cur (mg/l)

Độ hấp thụ quang

1.10-4 0,16 1.10-3 1,96

2.10-4 0,53 1,2.10-3 2,32

4.10-4 0,90 1,4.10-3 2,64

6.10-4 1,24 1,6.10-3 2,92

8.10-4 1,61

0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012 0.0014 0.0016 0.0018

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Do hap thu quang

Nong do (mg/l)

Linear Regression for Data1_B:

Y = A + B * X

Parameter Value Error --- A 0.12872 0.04724 B 1797.6087 49.57842 --- R SD N P --- 0.99735 0.07435 9 <0.0001

Hình 3.11: Đường chuẩn của curcumin

Từ đồ thị trên ta có phương trình hồi quy của Curcumin là:

y = (0,1287 ± 0,0472) + (1797,608 ± 49,578)x với hệ số tương quan R = 0,99735

* Đường chuẩn của Fe3O4 – CS – Cur

Với việc đo độ hấp thụ quang của Fe3O4 – CS – Cur theo nồng độ, chúng tôi thu được bảng số liệu 3.9 và hình 3.12:

Bảng 3.9: Kết quả đo UV-Vis của Fe3O4 – CS – Cur trong dung môi etanol Nồng độ CM(mg/l)

Fe3O4-CS-Cur

Độ hấp thụ quang (A)

Nồng độ CM (mg/l) Fe3O4-CS-Cur

Độ hấp thụ quang (A)

1.10-2 0,101 1.10-1 1,58

2.10-2 0,31 1,2.10-1 1,93

4.10-2 0,6 1,3.10-1 2,08

6.10-2 0,91 1,4.10-1 2,26

8.10-2 1,25 1,5.10-1 2,42

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Do hap thu quang

Nong do (mg/l)

Y = A + B * X

Parameter Value Error --- A -0.05511 0.01111 B 16.46129 0.11372 --- R SD N P --- 0.99981 0.01734 10 <0.0001

Hình 3.12: Đường chuẩn của Fe3O4 – CS – Cur Ta thu được phương trình đường chuẩn của Fe3O4 – CS – Cur y = (– 0,05511 ± 0,01111) + (16,461 ± 0,114).x

với hệ số tương quan R = 0,99981.

3.2.3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

* Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD được xem là nồng độ thấp nhất (xi) của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích (y) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín

hiệu nền.

Tức là yL  yb kSb

Trong đó yb là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm, Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lượng số học được chọn theo độ tin cậy mong muốn.

Ta có

1

1 nb

b bj

b j

y y

n 

  2  2

1

1 1

nb

b bi b

b i

S x x

n 

 

 

Vậy L b b

y y kS

  b

Mẫu trắng được pha với nồng độ chất phân tích xb = 0, do đó giới hạn phát hiện:

LOD kSb

 b

Trong trường hợp không phân tích mẫu trắng thì có thể xem độ lệch chuẩn của mẫu trắng Sb đúng bằng sai số của phương trình hồi quy, hay Sb = Sy và tín hiệu khi phân tích mẫu nền yb = a. Khi đó tín hiệu thu được ứng với nồng độ phát hiện yLOD = a + k.Sy.

Với độ tin cậy 95% thì giá trị của k = 3, sau đó dùng phương trình hồi quy tìm giá trị LOD: xLOD 3.Sy

 b

Kết quả xác định LOD được nêu ở bảng 3.10 * Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích (yQ) khác có nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền

Q b . b

Y  y K S

Thường thì LOQ được tính với K = 10 hay CQ = 10.SB /b nên LOQ = 3,3.LOD Từ các giá trị đo được về sự phụ thuộc độ hấp phụ của Curcumin và Fe3O4 – CS – Cur vào nồng độ ta tính được giá trị LOD và LOQ như trong bảng 3.10

Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất

Chất

Sy (độ lệch chuẩn của phương trình

hồi quy)

b (độ dốc của phương trình hồi

quy)

LOD (ppm)

LOQ (ppm)

Cur 11,085 1797,608 0,0185 0,0555

Fe3O4- CS – Cur 17,338 16,461 3,164 9,492

Từ giá trị giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tính được ở trên, trong quá trình tiến hành xử lý mẫu cần pha loãng cho phù hợp.

3.2.3.3. Đánh giá phương trình đường chuẩn

Ở phần trên ta đã tìm được phương trình đường chuẩn của chất phân tích có dạng y = a + b.x và trường hợp lý tưởng xảy ra khi a = 0. Tuy nhiên, trong thực tế trong quá trình tiến hành thí nghiệm luôn có sự sai số với nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến ta luôn thu được a ≠ 0. Nếu giá trị a ≠ 0 có ý nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích sẽ mắc sai số hệ thống. Vì vậy ta cần kiểm tra xem giá trị a và giá trị 0 khác nhau có ý nghĩa thống kê hay không trước khi sử dụng đường chuẩn cho phân tích.

Nếu coi a  0 thì phương trình đường chuẩn y = a + bx được viết lại có dạng y = b’x.

Sử dụng phần mềm minitab ta tính được giá trị F để so sánh sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 của phương trình đường chuẩn. Kết quả được ghi ở bảng 3.11.

Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa giá trị a và giá trị 0

Chất Ftính Fbảng

Cur 1,29 3,87

Fe3O4-CS–Cur 3,38 3,5

Như vậy ta thấy Ftính < Fbảng thì có thể kết luận giá trị a và 0 khác nhau không có ý nghĩa thống kê hay phương pháp xác định không mắc sai số hệ thống.

Tiếp theo chúng ta sẽ kiểm tra sự khác nhau giữa giá trị b và giá trị b’. Khi không có sai số hệ thống thì phương trình y = a + bx trở thành phương trình y = a + b’x, tức là sự khác nhau giữa b và b’ không có ý nghĩa thống kê. Do vậy có thể dùng chuẩn t để kiểm tra sự khác nhau của 2 giá trị trung bình. Dựa vào phần mềm Minitab 14 để so sánh 2 giá trị trung bình.

Kết quả so sánh giữa b và b’ trong phương trình đường chuẩn của Curcumin và Fe3O4 – CS – Cur được ghi ở bảng 3.12.

Bảng 3.12: Kết quả so sánh giữa b và b’ trong

phương trình đường chuẩn của Curcumin và Fe3O4 – CS – Cur Trung bình

(Mean)

Độ lệch chuẩn (SD)

Độ sai chuẩn (SE of mean)

Pvalue

Cur (N = 9)

b 1671,6 408 156 0,108

b’ 2021,5 293 98

Fe3O4 – CS – Cur (N = 10)

b 16,500 1,388 0,31 0,051

b’ 15,155 1,82 0,58

Như vậy ta có Pvalue = 0,108 > 0,05 nên ta có thể kết luận phương sai của b và b’ khác nhau không có nghĩa hay chúng giống nhau. Sau đó ta dùng chuẩn t để xem xét tiếp. Sử dụng minitab ta có kết quả như bảng 3.13:

Bảng 3.13: Kết quả so sánh giữa giá trị b và giá trị b’

Chất ttính tbảng

Cur 1,87 2,12

Fe3O4-CS–Cur 2,08 2,1

Từ kết quả trên ta có tbảng > ttính nên b và b’ khác nhau không có ý nghĩa thống kê hay phương pháp phân tích không mắc sai số hệ thống.

3.2.3.4. Đánh giá độ lặp của phương pháp

Để đánh giá độ lặp của phương pháp chúng tôi đánh giá độ lặp của thiết bị.

Với một hệ máy có độ nhạy cao thì sự lặp lại và ổn định cao đóng vai trò quan trọng trong phân tích. Lặp lại tốt mới có thể cho độ chính xác tốt trong một phạm vi cho phép. Để đánh giá độ lặp của thiết bị tiến hành đo độ hấp thụ trên máy UV – Vis ở cùng nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát ở nhiều lần khác nhau. Quá trình khảo sát ở đây, tôi tiến hành đo độ hấp thụ của Curcumin ở nồng độ 1,6.10-3 (mg/l) và của Fe3O4 – CS – Cur ở nồng độ 1,4.10-1 (mg/l) lặp lại trong 10 lần. Kết quả thu được như ở bảng 3.14.

Bảng 3.14: Độ lặp lại của phép đo phổ UV-Vis

Lần lặp Độ hấp thụ quang Cur Độ hấp thụ quang Fe3O4 – CS – Cur

Lần 1 2,91 2,27

Lần 2 2,90 2,29

Lần 3 2,93 2,28

Lần 4 2,92 2,24

Lần 5 2,94 2,25

Lần 6 2,89 2,23

Lần 7 2,88 2,30

Lần 8 2,95 2,27

Lần 9 2,93 2,26

Lần 10 2,91 2,22

Giá trị trung bình 2,916 2,261

RSD(%) 0,13 0,04

Kết quả trên cho thấy RSD < 1% chứng tỏ điều kiện và hệ thống thiết bị làm việc khá ổn định và phù hợp với phương pháp phân tích.

3.2.3.5. Đánh giá độ đúng của phương pháp

Để đánh giá độ đúng của phương pháp chúng tôi dùng phương pháp thêm

chuẩn. Trong quá trình phân tích, chúng tôi thấy nền mẫu nano chitosan từ tính không ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang của curcumin trong mẫu vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp thêm chuẩn.

Với dung dịch mẫu Fe3O4 – CS – Cur ta tiến hành như sau: từ dung dịch gốc ban đầu có nồng độ 1g/l, chúng tôi tiến hành lấy 1ml pha trong dung môi etanol thành 10ml để được dung dịch có nồng độ 0,1g/l. Làm tương tự để được dung dịch có nồng độ 0,05mg/l. Lấy 2ml dung dịch có nồng độ 0,05mg/l cho vào các bình định mức 10ml, sau đó thêm lần lượt 0, 1ml, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml dung dịch có nồng độ 0,01mg/l vào các bình trên và định mức đến vạch bằng dung môi etanol tuyệt đối. Sau đó đem đo UV-Vis của các dung dịch, trong đó mỗi mẫu được đo 3 lần ta được các tín hiệu yx, yx1, yx2… Kết quả trung bình được trình bày ở bảng 3.15.

Bảng 3.15: Kết quả đo phổ hấp thụ UV-Vis của Fe3O4 – CS – Cur trong phương pháp thêm chuẩn

Lượng mẫu thêm vào (ml)

0 1 2 3 4 5

Độ hấp thụ quang

0,11 0,1214 0,1324 0,1424 0,1527 0,1667

Nồng độ chất phân tích Cx được tính theo công thức tương tự như trên. Kết quả xác định nồng độ chất phân tích khi thêm chất chuẩn được ghi ở bảng 3.16.

Bảng 3.16: Kết quả xác định nồng độ Fe3O4 – CS – Cur trong phương pháp thêm chuẩn Thể tích chất chuẩn

thêm vào (ml)

Nồng độ chất phân tích Cx (mg/l)

Hiệu suất (%)

1 0,0480 96

2 0,0491 98,2

3 0,0510 102

4 0,0515 103

5 0,0485 97

Cx 0,04962 99,24

Kết quả đo được nồng độ của Fe3O4 – CS – Cur trong mẫu đạt hiệu suất khá cao từ 96% đến 103% cho thấy phương pháp xử lý mẫu này đáng tin cậy.

3.3. Ứng dụng phân tích curcumin trong mẫu và đánh giá hiệu quả mang curcumin lên mẫu