2.3.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào
Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng ra học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều bao gồm các đơn vị nhỏ tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt đó là các tế bào.
Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền giống nhau. Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật các nha khoa học đã đạt được những thành công chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Các tế bào lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ...) nếu được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy thích hợp đều có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc trƣng cho loài và ra hoa kết quả mình thường. Các loại mô đã phân hóa tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, ngoài ra chúng còn có khả năng phát triển thành tế bào mô sẹo (callus). Đó là loại tế bào không phân hóa, phân chia liên tục và có khả năng phân hóa thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh.
Nhƣ vậy mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào.
Tính toàn năng là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển và hoàn thiện. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực của công tác giống cây trồng, đƣa nghề trồng trọt vào thế kỷ của công nghệ hiện.
2.3.2. Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh và nhân nhanh giống
Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng, ở các cây nhiễm bệnh virus, virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trưởng của cây. Phát hiện đó là cơ sở để Morel và Martin (1952) chứng minh giả thuyết trên bằng cách tạo đƣợc cây sạch bệnh virus từ 6 giống khoai tây qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng [1].
Năm 1976, Morel đã thực hiện bước ngoặt khi áp dụng thành công kỹ thuật này trong nhân nhanh các loài địa lan Cymbidium thông qua protocom.
Sau đó, việc phát hiện ra cytokinin và môi trường nuôi cấy cải tiến (Murashige & Skoog, 1962) đã tạo sức sống mới để ứng dụng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân giống thương mại ở thực vật.
Ngày nay, kỹ thuật này cùng với một số cải tiến đã trở thành một phương pháp loại trừ bệnh virus đƣợc sử dụng rộng rãi đối với nhiều loại cây trồng khác nhau. Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm các phương pháp:
- Nuôi cấy mô phân sinh (meristem culture) thực chất là nuôi cấy phần đỉnh sinh trưởng không kèm theo lá mầm.
- Nuối cấy đỉnh sinh trưởng (meristem tip culture) bao gồm chóp sinh trưởng và một số mầm lá. Trong thực tế nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được dùng phổ biến để tạo cây sạch bệnh
- Nuối cấy đỉnh chồi (Shoot tip) thường dùng để nhân nhanh invitro, khác với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chủ yếu ở kích thước mẫu nuôi cấy. Đỉnh sinh trưởng nhỏ (0,1 - 0,5 mm) so với đỉnh chồi (0,5 - 5,0mm).
2.3.3. Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng tới quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất
này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định. Trong nuôi cáy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin.
- Nhóm Auxin
Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hormon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào.
Chính chức năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó.
Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α - naphtylaxetic (α - NAA), Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích thích quá trình phân chia tế bào thường được sử dụng nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho cây con. Tuy nhiên, tầm quan trọng của bất cứ chất điều tiết sinh trưởng nào đều có thể được đánh giá thông qua số các công trình nghiên cứu về chúng.
Nhóm giberelin là nhóm đƣợc phát hiện thông qua nhiên cứu bệnh nấm lúa von. Nhóm này có tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cho cây lùn có thể cao lên đƣợc, nhƣ ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), đƣợc sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp.
- Nhóm Cytokinin
Việc phát hiện ra xytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cây mô tế bào thực vật. Năm 1955 Miller và Skoog phát hiện và chiết xuất từ tinh dịch cá thu một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh mẽ trong nuôi cấy mô gọi là kinetin (6 - furfuryl - aminopurin - C10H 9N 5O).
Letham và Miller (1963) lần đầu tiên đã tách đƣợc xytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính tương tự kinetin. Sau đó người ta đã phát hiện xytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và là một nhóm phytohormone quan trọng ở trong cây. Trong các loại xytokinin thì 3 loại sau đây là phổ biến nhất: Kinetin (6 - furfuryl - aminopurin), 6 - benzin - aminopurin và Hiện nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại xytokinin trong các bộ phận đang sinh trưởng của cây. Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng xytokinin đƣợc hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ. Ngoài ra một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp xytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh.... Người ta cũng đã phát hiện ra kinetin là loại xytokinin có nhiều ở trong nước dừa. Xytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể vận chuyển theo hướng ngọn và hướng gốc. Xytokinin có thể ở dạng tự do và dạng liên kết tương tự như các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải dưới tác dụng của enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê. Các xytokinin tổng hợp đƣợc sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô là kinetin và benzyladenin.
Vai trò đặc trƣng của xytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ. Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do xytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và protein dẫn đến kích sự phân chia tế bào. Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và xytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng nhƣ trên cây nguyên vẹn.
Nếu tỷ lệ auxin cao hơn xytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ xytokinin cao hơn auxin thì kích thích ra chồi. Ðể tăng hệ số nhân giống, người ta thường tăng nồng độ xytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi. Ở trong cây rễ là cơ quan tổng hợp xytokinin chủ yếu nên rễ phát triển
mạnh thì hình thành nhiều xytokinin và kích thích chồi trên mặt đất cũng hình thành nhiều. Xytokinin kìm hãm quá trình già hóa của các cơ quan và của cây nguyên vẹn. Nếu nhƣ lá tách rời đƣợc xử lý xytokinin thì duy trì đƣợc hàm lƣợng protein và chlorophin trong thời gian lâu hơn và lá tồn tại màu xanh lâu hơn. Hiệu quả kìm hãm sự già hóa, kéo dài tuổi thọ của các cơ quan có thể chứng minh khi cành dâm ra rễ thì rễ tổng hợp xytokinin nội sinh và kéo dài thời gian sống của lá lâu hơn. Hàm lƣợng xytokinin nhiều làm cho lá xanh lâu do nó tăng quá trình vận chuyển chất dinh dƣỡng về nuôi lá. Trên cây nguyên vẹn khi bộ rễ sinh trưởng tốt thì làm cho cây trẻ và sinh trưởng mạnh, nếu bộ rễ bị tổn thương thì cơ quan trên mặt đất chóng già. Xytokinin trong một số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và của củ. Vì vậy nếu xử lý xytokinin có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt củ mầm.
Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm này gồm: 6 - benzyl aminopurine (BAP), 6 - Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin.
Rất nhiều cytokinin đƣợc phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô, nó kích thích phân hóa cơ quan của những tế bào không phân chia. Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã sử dụng kết hợp BAP và NAA để tạo chồi từ mắt ngủ hay đỉnh sinh trưởng. Rachael keolanui đã sử dụng BAP để tạo chồi khoai môn từ các mắt ngầm và đỉnh sinh trưởng.
- Nhóm Ethylen
Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây nhưng gần đây nó mới được coi là một hormon thực vật. Ethylen thường đƣợc sử dụng để làm chính quả nhƣ ở chuối, hồng, hồng xiêm... làm ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào. Đối với cà chua trong điều kiện nồng độ ethylen cáo xẽ kéo dài khoảng ra rễ ở thân cây...
Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngăn ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein.
PHẦN 3