PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng của HgCl2 0.1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn - Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến
khả năng tái sinh chồi cây Đinh lăng.
- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng tới khả năng nhân nhanh của chồi Đinh lăng.
- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Auxin(NAA, IBA)và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng . - Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm 3.5 . Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Điều kiện bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
- Các bình nuôi cấy In vitro đƣợc đặt trong phòng nuôi cấy có chế độ chiếu sáng 16h sáng / 8 h tối với cường độ chiếu sáng 2000- 2500 lux. Nhiệt độ phòng nuôi cấy :25 ± 20 C.
- Độ ẩm không khí : 65 – 70 % .
3.5.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
+ Sử dụng môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962), B5 (Gamborg’s), WPM có bổ sung Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l, pH: 5,6-5,8
+ Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và Cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm
+ Thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50-70 ml/bình
+ Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1,1 atm trong 18 phút 3.5.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp khử trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn từ mẫu Đinh lăng
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl20,1% đến khả năng vô trùng mẫu
- Chuẩn bị mẫu:
Mô phân sinh đỉnh cây Đinh lăng được rửa sạch bằng nước máy để loại bỏ bụi bẩn. Sau đó rửa mẫu bằng xà phòng loãng, rửa sạch mẫu dưới vòi nước máy để loại bỏ hết xà phòng và bụi bẩn còn lại bám trên mẫu.
- Khử trùng mẫu: Mẫu đã rửa sạch sẽ đƣợc khử trùng bằng HgCl2 0,1%
ở các khoảng thời gian khác nhau .Sau đó, rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 - 7 lần. Ngâm mẫu trong nước cất khoảng 5 phút.
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, cấy 15 mẫu cho mỗi công thức. Tiến hành theo dõi và đánh giá sau 7 ngày nuôi cấy.
- Công thức thí nghiệm:
Hóa chất Công thức Thời gian
HgCl2 0.1%
CT1 5 phút
CT2 7 phút
CT3 10 phút
CT3 12 phút
CT5 15 phút
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ mẫu vô trùng:
+Tỷ lệ mẫu sống bị nhiễm:
+Tỷ lệ mẫu chết:
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi cây Đinh lăng.
- Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm có 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình cấy một mẫu.
- Công thức thí nghiệm:
CT Môi trường
1(Đ/C) MS
2 B5
3 WPM
4 SH
Trong các công thức có bổ sung Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l, pH: 5,6-5,8.
- Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi trong 30 ngày + Tỷ lệ bật chồi không nhiễm (%):
3.5.5. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3
+ Sử dụng môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin và Cytokinin vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm
+ Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5-1cm, dùng pank đã đƣợc khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường đã được chuẩn bị trước.
+ Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đƣa vào phòng nuôi. Sau đó tiến hành theo dõi số chồi, hệ số nhân và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
- Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi trong 30 ngày + Số chồi mới hình thành (chồi/mẫu) + Hệ số nhân (lần):
Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi thu đƣợc (chồi) Tổng số chồi nuôi cấy (mẫu) + Chất lƣợng chồi bật:
Chồi tốt: Chồi mập, xanh.
Chồi trung bình: Chồi mập, xanh nhạt Chồi kém: Chồi bé, xanh nhạt.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nồng độ loại cytokine(kinetine,BA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ.
- Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm có 7 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy một mẫu
- Công thức thí nghiệm
Hóa chất CT Nồng độ (mg/l)
kinetine
1(Đ/C) 0,0
2 0,5
3 1
4 1.5
5 2
BA
6 0.5
7 1
8 1.5
9 2
MT nền = Môi trường tái sinh chồi tốt nhất (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) có bổ sung thêm Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l, pH = 5,6-5,8.
Nồng độ cytokinin thích hợp cho nhân nhanh chồi Đinh lăng xác định ở thí nghiệm 3 (ký hiệu A) đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nồng độ loại Cytokine thích hợp nhất (A) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng.
- Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm có 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy một mẫu.
- Công thức thí nghiệm:
Hóa chất CT Nồng độ (mg/l)
NAA
1(Đ/C) Nền + A + 0,0
2 Nền + A + 0,1
3 Nền + A + 0,5
4 Nền + A +1,0
5 Nền + A + 1,5
MT nền = Môi trường tái sinh chồi tốt nhất (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) có bổ sung thêm Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l, pH = 5,6-5,8.
3.5.6. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4
Lựa chọn chồi Đinh lăng có từ 2-3 lá chuyển sang môi trường ra rễ.
Môi trường ra rễ dựa trên môi trường MS có bổ sung các nồng độ Auxin khác nhau để kích thích tạo rễ, hình thành cây con hoàn chỉnh.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Auxin (NAA, IBA) và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng.
- Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm có 9 công thức, mỗi công thức nhắc lại 2 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình cấy một mẫu.
- Công thức thí nghiệm:
Hóa chất CT Nồng độ (mg/l)
NAA
1(Đ/C) Nền + A + 0,0
2 Nền + A + 0,1
3 Nền + A + 0,5
4 Nền + A +1,0
5 Nền + A + 1,5
IBA
6 Nền + A + 0,1
7 Nền + A + 0,5
8 Nền + A +1,0
9 Nền + A + 1,5
MT nền = Môi trường tái sinh chồi tốt nhất (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) có bổ sung thêm Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l, pH = 5,6-5,8.
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ chồi ra rễ (%):
+ Số rễ trung bình/cây (rễ):
+ Chất lượng rễ:
+Rễ tốt: Dài, nhiều lông hút
+Rễ trung bình: Rễ ngắn, nhiều lông hút +Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ, ít lông hút
Thí nghiệp 6: Nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm
+ Công thức thí nghiệm
CT1: Mùn hữu cơ
CT2: Trấu hun + Đất
CT3: Đất + Trấu hun + Mùn hữu cơ (1:2:1) + Phương pháp nghiên cứu:
Các công thức đƣợc bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu.
+ Chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ cây sống
100
3.5.7. Phương pháp xử lý số liệu
- Các số liệu đƣợc tính toán bằng phần mềm Excel 2010.
- Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính theo chương trình IRRISTART 4.0.
- Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ƣớc lƣợng và sử dụng tiêu chuẩn LSD ( Least Significant Different) ở độ tin cậy 95%.
- Kiểm tra độ biến động của các thí nghiệm đƣợc biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%.
PHẦN 4