PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Hình 3.1: Sơ đồ minh họa các bước biểu hiện gene mã hóa lysin Thiết kế vector
biểu hiện pET 32a(+) mang
gene lysK
Biểu hiện Lysin phage trong vi
khuẩn E.coli BL21 Star
(DE3)
Tối ưu một số điều kiện biểu hiện lysin phage
3.4.1. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp pCR 2.1 và pET32 bằng enzyme giới hạn
H2O 2 àl
Buffer 3 10X 1 àl
BamHI (1u) 1 àl
XhoI (1u) 1 àl
Plasmid (150 àg) 5 àl
Tổng thể tớch 10 àl
Các thành phần của phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ 370C trong thời gian 2 giờ hoặc qua đêm.
3.4.2. Phương pháp điện di trên gel Agarose
Về nguyên lý của phương pháp điện di DNA, các đoạn DNA mang điện tích âm nên di chuyển từ cực âm sang cực dương trong dung dịch tự do và dưới tác dụng của điện trường. Khi di chuyển trong gel, các đoạn DNA có kích thước và cấu trúc không gian khác nhau sẽ được phân tách. Sau đó nhuộm DNA bằng ethidium bromide để quan sát DNA trên đèn tử ngoại.
Hóa chất điện di: Agarose 1% (tức là pha 1g agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X); dung dịch đệm chạy điện di TAE 1X ( pha từ TAE 50X có thành phần gồm: Tris base, acid acetic, EDTA); hóa chất nhuộm Ethidium bromide; đệm tra mẫu loading dye.
Các bước tiến hành
- Đổ gel: đun gel agarose 1% sau đó để nguội khoảng 500C – 600C thì đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lược.
- Lắp thiết bị: sau khi gel đã đông, nhấc lược ra và đặt bản gel vào bể điện di.
- Trộn đều mẫu và đệm loading dye sau đó tra vào các giếng theo đúng thứ tự.
Dung dịch đệm tra mẫu có tác dụng làm tăng trọng lượng riêng của acid nucleic, vì vậy mà các phân tử acid nucleic bị kéo xuống đáy giếng và nhờ được gắn màu blue mà ta có thể quan sát dễ dàng quá trình di chuyển của chúng trong điện trường.
- Đậy nắp bể, tiến hành chạy điện di ở 100 V- 110 V. Quan sát khi mẫu chạy được 2/3 bản gel thì dừng lại.
- Nhuộm gel: Từ từ nhấc bản gel ra khỏi bể điện di và đặt vào dung dịch nhuộm ethidium bromide sao cho ngập bản gel. Thời gian nhuộm từ 5- 10 phút tùy từng bản gel. Thuốc nhuộm EtBr có tác dụng phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại giúp cho việc hiện hình các băng rõ hơn.
- Soi bản gel dưới tia cực tím.
3.4.3. Thu nhận DNA từ gel agarose ( thôi gel)
Sau khi điện di sản phẩm cắt đồng thời với 2 enzyme giới hạn đoạn gen và vector mở vòng được tinh sạch để đảm bảo hiệu quả gắn nối. Để thu đoạn DNA từ gel agarose, tôi sử dụng kit thôi gel S.N.A.P free UV của hãng Invitrogen. Quá trình này gồm 4 bước cơ bản: điện di, thu băng DNA cần quan tâm, gắn DNA lên cột, đẩy DNA ra khỏi cột.
Cụ thể các bước như sau:
- Chạy điện di mẫu cắt cần nghiên cứu, nhuộm gel bằng Et r, đặt lên máy soi gel, quan sát và cắt đoạn gen mong muốn vào ống effendoff.
- Bổ sung dung dịch Binding buffer ( V binding buffer : V gel = 2:1)
- Ủ 550C- 580C trong thời gian 10 phút để gel tan hoàn toàn ( 5 phút đảo ống một lần để gel tan đều).
- Chuyển hỗn hợp gel tan sang cột và đặt vào ống thu mẫu - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút
- Loại dịch qua cột và đặt ống trở lại ống thu
- Bổ sung 700 l Wash solution, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch qua cột
- Đặt cột vào ống effendof mới, bổ sung 50 l Elution vào cột, đợi 5 phút ở nhiệt độ phòng rồi ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, thu DNA. Bảo quản ở - 20C 3.4.4. Gắn đoạn gen mã hóa lysin vào vector biểu hiện
Để chèn gen lysK vào vector biểu hiện pET32a(+), lysK được cắt ra khỏi vector tách dòng pCR2.1 bằng BamI và XhoI và gắn vào vector pET32a(+) đã được mở vòng bằng 2 enzyme tương ứng là BamHI và XhoI tạo thành plasmid tái tổ hợp pET32lysK.
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng gắn gene vào vector biểu hiện Thành phần Thể tớch (àl)
H2O 2 àl
Buffer T4 ligase 10X 1 àl
Vector pET32a(+) (150 àg) 2 àl
T4 DNA ligase (1u) 1 àl
Gen lysK (150 àg) 4 àl
Tổng thể tớch 10 àl
Điều kiện để phản ứng gắn nổi xảy ra: ủ ống mẫu ở 220C trong 1 giờ hoặc ở 140C qua đêm.
3.4.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli
Có hai phương pháp để biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào khả biến đó là xung điện và shock nhiệt. Xung điện có ưu điểm hơn shock nhiệt là có hiệu suất biến nạp cao, tuy nhiên lại có nhược điểm làm chết nhiều tế bào. Vì vậy tôi thực hiện quá trình biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến được bằng phương pháp sốc nhiệt.
Về nguyên tắc, để biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn, tế bào được xử lý bằng CaCl2 để tăng khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai. Tạo hỗn hợp gồm vi khuẩn và DNA plasmid để trong điều kiện lạnh sau đó ủ hỗn hợp ở nhiệt độ cao rồi lại quay về nhiệt độ lạnh. Chính sự thay đổi nhiệt độ đột ngột giúp DNA plasmid xâm nhập vào bên trong tế bào vi khuẩn. Tiếp theo lấy những vi khuẩn đó nuôi cấy trong môi trường thích hợp và do đó DNA plasmid được sao chép và mã hóa cùng với DNA vật chủ (Ho Huynh Thuy Duong, 2008).
Quy trình biến nạp gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.
a) Tạo tế bào khả biến:
- Chủng E. coli được nuôi qua đêm trong môi trường LB ở 370C, tốc độ lắc 200 vòng/phút.
- Lấy 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường LB lỏng, tiếp tục nuôi lắc 2h ở 370C, 200 vòng/phút, kiểm tra mật độ tế bào ở OD 600nm = 0.6- 1 là đạt yêu cầu.
- Đặt ống khuẩn trong đá, để khoảng 30 phút, thỉnh thoảng lắc đều - Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, ở 40c để thu sinh khối tế bào
- Rửa cặn tế bào lần 1 bằng CaCl2 100 mM lạnh ( V dịch : V CaCl2 = 1:1) - Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi
- Rửa cặn tế bào lần 2 bằng CaCl2100 mM lạnh ( V dịch : V CaCl2 = 10:1) - Ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút, thu cặn tế bào
- Hòa tan cặn tế bào thành huyền dịch bằng CaCl2, giữ trên đá 1h trước khi biến nạp.
b) Biến nạp DNA vào tế bào khả biến
- Bổ sung toàn bộ sản phẩm của phản ứng lai vào ống chứa tế bào khả biến - Giữ trên đá 30 phút
- Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút 30 giây, sau đó chuyển nhanh lên khay đá - Bổ sung 250 l môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở 370C trong 1 giờ
- Cấy trải 100 l trờn mụi trường thạch LB, IPTG (100 àg/ml), Amp (100 àg/ml)
- Ủ đĩa đã cấy trong tủ ấm 370C qua đêm.
3.4.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
Chúng tôi sử dụng bộ kit của hãng Themo scientific để tách chiết và tinh sạch plasmid. Quy trình gồm các bước như sau
- Thu 1,5 ml dịch tế bào nuôi cấy qua đêm ở 370C trong môi trường LB lỏng - Ly tâm dịch tế bào ở 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu cặn tế bào
- Bổ sung 250 àl Resuspension Solution ( giữ ở 40C), vortex tan cặn - Bổ sung tiếp 250 àl Lysis Solution, lắc đều bằng tay từ 2- 3 lần - Bổ sung 350 àl Neutralization Solution , lắc đều
- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút
- Hút toàn bộ dịch pha trên sang ống cột lọc ( đi kèm với bộ kit) - Ly tâm ống cột lọc ở 12000 vòng/phút trong 1 phút
- Loại bỏ dịch bờn dưới ống, bổ sung 500 àl Wash Solution lờn cột - Ly tâm loại dịch ở 12000 vòng/phút trong 1 phút
- Làm lại bước rửa thêm 1 lần nữa
- Sau khi ly tâm, loại bỏ dung dịch dưới cột. Ly tâm ống cột lọc 12000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash solution
- Chuyển cột sang ống Ependof mới, bổ sung 50àl Elution Bufer - Để 3- 5 phút ở nhiệt độ phòng
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút - Thu nhận plasmid, giữ ở -200C.
3.4.7. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
Theo Frederick Sanger, nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của enzyeme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ có chứa nhóm OH tự do, khi gặp nu không có nhóm 3’- OH thì phản ứng tổng hơp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là sử dụng dioxynucltide để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu nhiên (Khuat Huu Thanh, 2012).
Trình tự DNA được xác định theo phương pháp của Sanger đồng tác giả, trên máy xác định trình tự DNA tự động ABI prism 3100 Sequencer (Applied iosystems) với bộ kit xác định trình tự igDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied iosystems. Quy trình xác định trình tự được tiến hành theo 3 bước:
- Bước 1: Thực hiện phản ứng tổng hợp với các thành phần như bảng 2.4:
Bảng 3. : Thành phần phản ứng để ác định tr nh tự
Thành phần Thể tích ( l)
H2O khử ion vô trùng 5,725 l
Bigdye 3 l
DNA (200ng) 2 l
Mồi (3,2 pmol/ l) 1,275 l
Đệm 2.5 X 3 l
Tổng thể tích 15 l
Chu trình nhiệt được thực hiện như sau: 960C/1 phút, 960C/10 giây, 500C/5 giây, 600C/ 4 phút, 25 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4), 600C /4 phút, kết thúc ở 40C.
- Bước 2: Tinh sạch sản phẩm sau khi tổng hợp + ổ sung 5l EDTA 12,5 mM, pH=8.
+ ổ sung 60 l Ethanol 100%. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút + Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút để thu cặn
+ Rửa cặn bằng 60 l Ethanol 70%. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn
+ Làm khô cặn trong 3 phút bằng máy Speed vac + Hòa cặn trong 10 l Hidiformamide
+ iến tính ở 950C trong 3 phút
- Bước 3: Xác định trình tự trên máy tự động A I 3100 Avant 3.4.8. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli
- Nuôi hoạt hóa tế bào vi khuẩn E. coli BL21 Star (DE3) mang plasmid tái tổ hợp trong mụi trường LB lỏng, bổ sung Amp (100àg/ml) ở 370C lắc qua đờm
- Cấy chuyển 1%- 2% dịch hoạt hóa sang môi trường LB lỏng- Amp, tiếp tục nuôi lắc ở 370C trong 2- 3 giờ ( OD600nm đạt khoảng 0,5-0,6)
- Tế bào được cảm ứng kích thích khả năng sinh tổng hợp protein tái tổ hợp bằng cách bổ sung IPTG với nồng độ thích hợp, nuôi ở nhiệt độ và thời gian nuôi thích hợp để thu được lysin ở trạng thái hòa tan được nhiều nhất.
- Sau khi nuôi cảm ứng, thu tế bào và kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng cách điện di trên gel polyacrylamide.
3.4.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
Về nguyên lý của phương pháp điện di protein: β – Mercaptoethanol trong đệm sampe buffer có tác dụng làm biến tính các phân tử protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 về cấu trúc bậc 1. SDS có tác dụng làm âm tính hóa các phân tử protein, vì vậy khi chạy điện di dưới tác dụng của điện trường các phân tử này di chuyển từ cực âm sang cực dương. Các protein có trọng lượng phân tử khác nhau sẽ di chuyển với tốc
độ khác nhau trong điện trường. Sau khi nhuộm bản gel với dung dịch phù hợp, ta có thể quan sát được sự phân tách của các phân tử trên bản gel.
Tiến hành:
Bổ sung sample buffer vào các mẫu protein, biến tính mẫu ở 1000C trong 10 phút. Tiến hành tra vào các giếng trên bản gel polyacrylamide (gel cô mẫu 4%
acrylamide, gel phân tách mẫu có 12,5% polyacryl amide). Chạy điện di với đệm SDS – PAGE 1X với cường độ dòng điện là 40 mA. Bản gel được nhuộm với dung dịch nhuộm trong 1 giờ và tẩy nhuộm trong 2 giờ.
3.4.10. Phương pháp biểu hiện- xác định trạng thái tồn tại của lysin
- Cặn tế bào BLpETLys sau khi biểu hiện được hòa trong 300 l đệm phá (150mM NaCl, 20mM TrisHCl pH 8, 0,1 mM PMSF)
- Phá tế bào bằng phương pháp siêu âm.
- Ly tâm loại xác ở 5000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút dịch trong ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch nổi. Hòa lại cặn trong 300 l đệm phá.
- Điện di kiểm tra pha dịch và pha cặn trên gel polyacrylamide 12,5%.
Phần 4