Để biểu hiện gen mã hóa protein lysin, chúng tôi sử dụng chủng E. coli BL21 Star (DE3). Chủng này có ưu điểm là hạn chế được sự phân cắt protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai ổn định hơn trong tế bào sau khi được tổng hợp. Ngoài ra, DNA hệ gen của E. coli BL21 Star (DE3) có chứa gen mã hóa cho T7 RNA polymerase (có nguồn gốc từ bacteriophage lambda). Gen này được đưa vào hệ gen của E. coli BL21 Star (DE3) và bị kiểm soát bởi promoter lacUV5 nên cần IPTG để cảm ứng sự biểu hiện T7 RNA polymerase.
Vector biểu hiện pET32a(+) mang gene lys với khung đọc chuẩn được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21 Star (DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch tế bào sau khi biến nạp được cấy trải trên môi trường L đặc có bổ sung Amp và nuôi ở 370C qua đêm. Kết quả biến nạp thu được các khuẩn lạc riêng rẽ. Chọn 1 khuẩn lạc riêng rẽ bất kì, nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C. Sau đó dịch nuôi cấy đó được chuyển sang môi trường LB lỏng với tỉ lệ (1:100) có bổ sung Amp và lắc tiếp cho đến khi OD600 đạt 0.6-0.8 (sau khoảng 2-3 giờ) thì bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ 1 mM (nhiệt độ 370C, nuôi lắc 200 vòng/phút), thu mẫu sau 3 giờ cảm ứng. Điện di kiểm tra kết quả biểu hiện protein trên gel polyacrylamide 12,5%.
Hình 4.4: Kết quả biểu hiện protein lysin
ĐC M: thang protein chuẩn (Understained); ĐC 1: mẫu không cảm ứng IPTG; ĐC 2: mẫu được cảm ứng IPTG với nồng độ 1 mM.
～70 kDa 116
62,2 kDa
45 35 25
M 1 2
Protein tổng số của dịch chiết được phân tích trên gel polyacrylamide (hình 4.5). Kết quả điện di cho thấy mẫu được cảm ứng 1 mM IPTG xuất hiện 1 băng đậm hơn so với các băng protein khác của vi khuẩn, và cũng đậm hơn so với băng protein tương ứng ở mẫu không cảm ứng. Băng này có kích thước khoảng 70 kDa, đúng như tính toán lý thuyết.
4.2.2. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện
Trước khi biểu hiện lượng lớn để thu nhận protein tái tổ hợp phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện nuôi cấy nhằm tìm ra điều kiện tối ưu nhất nhằm tạo ra lượng lysin nhiều và protein ở trạng thái hòa tan cao nhất. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và trạng thái biểu hiện của của protein đích trong các hệ thống biểu hiện tái tổ hợp. Đối với hệ thống biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian nuôi cấy sau cảm ứng là 3 yếu tố tác động nhiều nhất đến sự biểu hiện và trạng thái của protein tái tổ hợp. Trong thời gian thực tập, tôi và nhóm nghiên cứu đã tìm ra được nhiệt độ và nồng độ IPTG tối ưu để biểu hiện lysin.
4.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của tế bào vật chủ chứa plasmid tái tổ hợp, mặt khác nó cũng ảnh hưởng đến tính ổn định của plasmid trong tế bào từ đó gây ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng protein tái tổ hợp. Nhiệt độ càng cao thì khả năng đào thải plasmid của tế bào chủ càng lớn, đồng thời cũng làm cho mRNA dễ bị phá hủy. Một số protein ngoại lai được tổng hợp tốt ở 370C khi tốc độ sinh trưởng của chủng chủ đạt tối đa. Tuy nhiên, khi tế bào phát triển mạnh protein tái tổ hợp đươc tổng hợp liên tục liên tục thì một phần protein này tồn tại ở dạng không hòa tan. Các protein ở trạng thái không tan thường không đảm bảo được hoạt tính sinh học. Vì vậy cần phải khảo sát các nhiệt độ nuôi cấy để tìm ra nhiệt độ nuôi cấy thích hợp mà ở đó protein ngoại lai được tổng hợp nhiểu ở dạng hòa tan và có chất lượng tốt.
Để tiến hành khảo sát, chúng tôi nuôi cấy chủng E. coli BL21 StarTM (DE3) mang vector pET32a(+) tái tổ hợp ở 370C đến khi OD600 đạt 0,6- 0,8. Sau đó tế bào
được cảm ứng bởi 1 mM IPTG và tiếp tục được nuôi lắc ở các nhiệt độ khác nhau là: 180C trong 16 giờ, 250C trong 8 giờ, 300C trong 6 giờ, 370C trong 3 giờ. Ly tâm thu tế bào nuôi cấy, sau đó các mẫu được xử lý với điều kiện như nhau và tiến hành kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,5%.
Hình 4.5: Điện di kết quả biểu hiện lysin ở các nhiệt độ khác nhau
ĐC M : thang protein chuẩn (Understained); ĐC 1, 2,3: nuôi cùng, dịch nổi, cặn ở 250C; ĐC 4, 5: dịch nổi, cặn ở 180C; ĐC 6, 7, 8: dịch nổi, cặn, dịch sau siêu âm ở 370C; ĐC 9, 10, 11, 12: dịch nổi, cặn, dịch sau siêu âm, nuôi cùng ở 300C.
Kết quả điện di (hình 4.6) cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn tới quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp. Tại 370C, kết quả tổng hợp protein tái tổ hợp là tốt nhất. Tuy nhiên khi kiểm tra trạng thái biểu hiện thì ở 250C, 300C, 370C, protein lysin được biểu hiện chủ yếu dưới dạng không hòa tan, còn ở nhiệt độ 180C thì lượng lysin ở dạng hòa tan nhiều hơn. Như vậy, nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến trạng thái biểu hiện của protein tái tổ hợp. Ở nhiệt độ 250C, 300C, 370C vi khuẩn sinh trưởng mạnh do đó protein được tổng hợp nhanh trong hệ thống tế bào vật chủ và không được gấp nếp để tạo thành protein có cấu trúc giống với cấu trúc tự nhiên, làm cho các protein đó tạo ra sẽ tập trung lại thành dạng thể vùi (inclusion body). Vì vậy để đảm bảo được hoạt tính của của enzyme, chúng tôi chọn nhiệt độ để biểu hiện lysin là 180C.
kDa
116 66,2 45 35
25 18
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13131313 13 M
4.2.2.2. Ảnh hưởng của của nồng độ IPTG
IPTG được dùng làm chất cảm ứng kích hoạt E. coli sản xuất protein tái tổ hợp. Nồng độ IPTG ảnh hưởng rất lớn đến năng suất cũng như chất lượng của protein tái tổ hợp được tạo ra. Nếu nồng độ IPTG quá cao sẽ gây ức chế việc tổng hợp protein, nhưng nếu nồng độ IPTG quá thấp sẽ không đủ để cảm ứng promoter tạo nhiều protein. Do vậy nồng độ IPTG là yếu tố quan trọng cần khảo sát để tối ưu hóa quá trình biểu hiện protein. Để kiểm tra sự ảnh hưởng của nồng độ IPTG lên quá trình tổng hợp protein ngoại lai chúng tôi đã nuôi cấy chủng E. coli BL21 Star (DE3) tái tổ hợp ở 370C đến khi OD600 đạt 0,6-0,8. Sau đó, bổ sung vào dịch nuôi cấy với các nồng độ IPTG khác nhau: 0,1 mM; 0,4 mM; 0,7mM; 1,0 mM; 1,5 mM;
1,5 mM; 2 mM và tiếp tục được nuôi lắc ở 180C trong 16 giờ. Kết quả phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,5% (hình 4.7) cho thấy nồng độ IPTG khác nhau có ảnh hưởng khác nhau tới quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp.
Hình 4.6: Kết quả biểu hiện lysin ở các nồng độ IPTG
ĐC 1, 15: nuôi cùng không cảm ứng; ĐC 2,3: dịch nổi, cặn cảm ứng bằng 0,1mM IPTG; ĐC 4,5: dịch nổi, cặn cảm ứng bằng 0,4 mM IPTG; ĐC 6,7: dịch nổi, cặn cảm ứng bằng 0,7 mM IPTG; ĐC 8,9: dịch nổi, cặn cảm ứng bằng 1mM IPTG; ĐC 11, 12: dịch nổi, cặn cảm ứng bằng 1,5 mM IPTG; ĐC 13, 14: dịch nổi, cặn cảm ứng bằng 2 mM IPTG; ĐC M: thang chuẩn protein (Understained).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15
Từ kết quả điện di cho thấy lượng protein tái tổ hợp thu được ở nồng độ 0,7 mM và 1 mM là lớn nhất. Ở các nồng độ IPTG nghiên cứu, khi biểu hiện ở 180C protein tái tổ hợp đều tồn tại ở 2 trạng thái là dạng hòa tan và dạng không hòa tan (thể vùi). Ở nồng độ từ 0,1 mM; 0,4 mM; 0,7 mM, 1 mM protein lysin tồn tại ở trạng thái hòa tan nhiều hơn là ở dạng thể vùi. Khi nồng độ IPTG tăng lên (1,5 mM và 2 mM) thì protein có dấu hiệu biểu hiện tăng tuy nhiên lại tồn tại phần lớn dạng thể vùi, nếu tăng nồng độ IPTG cao hơn nữa,có thể sẽ gây độc cho tế bào. Ở nồng độ 0.7 mM và 1 mM IPTG thu được lượng protein tái tổ hợp cao và không có sự khác biệt, protein tồn tại cả trạng thái hòa tan và thể vùi. Kế thừa những nghiên cứu trước và chúng tôi đã chọn nồng độ tối ưu cho chất cảm ứng IPTG là 1 mM để biểu hiện lượng lớn phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Qua khảo sát trên, chúng tôi đã tìm được điều kiện tối ưu cho sự biểu hiện của lysin tái tổ hợp ở 180C, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 1 mM, thu mẫu sau 16 h cảm ứng. Đây cũng là điều kiện nuôi cấy được chúng tôi áp dụng cho các bước nghiên cứu sau này.
Phần 5