4.1.1. Kết quả thiết kế vector pET32(a+) mang gen lysK
Gen mã hóa lysin từ thực khuẩn thể K đặc hiệu Staphylococcus aureus đã được phòng Vi sinh phân tử tách dòng trong vector PCR2.1. Đoạn gen lysK này được khuếch đại bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu là: mồi xuôi lys - FP:
5’_CCGCTCGAGATGGCTAAGACTCAAGCAGAA-3’ mồi ngược lysK - RP:
5’_ CGGGATCCCTATTTGAATACTCCCCAGGCAA-3’, trong đó trình tự CTCGAG là vị trí cắt giới hạn của XhoI và trình tự GGATCC là vị trí cắt giới hạn của BamHI. Sản phẩm PCR sau đó được chèn vào vector tách dòng pCR2.1 tạo thành vector tái tổ hợp pCRlysK.
Để chèn được lysK vào vector biểu hiện pET32(a+), plasmid tái tổ hợp pCRlys và pET32(a+) được xử lý đồng thời bằng hai enzyme BamHI và XhoI. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1%, thu đoạn DNA tương ứng với lysK và vector pET32(a+) mở vòng bằng phương pháp thôi gel (bộ Kit Gel extraction của hãng Invitrogen), sau đó gắn chúng lại với nhau nhờ enzym T4 DNA ligase tạo vector tái tổ hợp pETlysK. Plasmid pETlysK sau đó được biến nạp vào tế bào tế bào E. coli DH5α và phát triển thành các khuẩn lạc trên môi trường LB - agar có bổ sung kháng sinh Amp. Để chọn lọc dòng plasmid tái tổ hợp mang gen lysK, chúng tôi nhặt một số khuẩn lạc riêng lẻ, nuôi lắc trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp ở 370C qua đêm. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc theo phương pháp đã trình bày ở trên và chạy điện di trên gel agarose 1 % kèm theo đối chứng là plasmid gốc.
Hình 4.1: Kết quả sàng lọc các dòng plasmid mang gen lysK bằng điện di trên gel Agarose
ĐC: Đối chứng plasmid pET32(a+) gốc, 1 – 5: plasmid tái tổ hợp tách từ các khuẩn lạc. ĐC 1 2 3 4 5
Trong quá trình chạy điện di, các phân tử DNA có kích thước càng nhỏ (dạng siêu xoắn) thì sẽ di chuyển càng nhanh trong điện trường và ngược lại, phân tử có kích thước càng lớn (dạng vòng) sẽ di chuyển chậm hơn. Kết quả sàng lọc sơ bộ cho thấy các dòng plasmid tái tổ hợp đều có kích thước lớn hơn vector pET32a(+) gốc không mang gen ngoại lai (đường chạy ngắn hơn). Điều này có khả năng do các khuẩn lạc trắng có gắn gen lysK nên có kích thước lớn hơn plasmid gốc.
4.1.2. Chọn lọc các dòng plasmid mang gen lysK bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn
Để khẳng định chắc chắn các dòng DNA plasmid có mang gen lysK, chúng tôi tiến hành xử lý cắt kiểm tra các DNA plasmid này bằng BamHI và XhoI. Chúng tôi chọn dòng plasmid tái tổ hợp pET32a(+)-lysK số 1 và 2 để kiểm tra khả năng mang gen bằng cắt với enzym giới hạn BamHI và XhoI, sau đó điện di trên gel agarose 1%.
Hình 4.2: Kết quả chọn lọc các dòng vector tái tái tổ hợp pET32a(+) mang gen lys ĐC M: Ladder DNA (Fermentas), ĐC 1, 2: plasmid tái tổ hợp cắt bằng BamHI và XhoI,
ĐC 3: sản phẩm PCR gene lysK
Kết quả phân tích sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp cho thấy sau khi cắt bằng enzyeme giới hạn tiến hành điện di trên gel agarose, ta thấy ở mỗi đường chạy đều có 2 băng, băng bên dưới có kích thước xấp xỉ 1500 bp bằng với kích thước sản phâm PCR gen lysK ở đường chạy số 3. Chứng tỏ các dòng plasmid kiểm tra đều mang gene lysK (1488 bp).
～1500 bp L 1 2 3
1000 bp 3000 bp
4.1.3. Kiểm tra chiều gắn khung đọc của đoạn chèn trong vector pET32a(+) Gen lysK trong vector pET32a(+) chỉ có thể biểu hiện khi chúng được gắn đúng chiều và được dịch mã thông suốt, không có mã kết thúc trong gen. Do đó, chúng tôi lựa chọn cả 1 dòng plasmid pET32a(+) mang gen ngoại lai sau khi đã kiểm tra bằng enzyme giới hạn để tinh sạch và giải trình tự gen. Kết quả phân tích trình tự gen cho thấy, trình tự gen lys trong vector biểu hiện pET32(a+) giống với trình tự gen lysK đã được tách dòng. Gen lys có gắn thêm trình tự nhận biết của hai enzyme giới hạn BamHI và XhoI. Như vậy, chứng tỏ quá trình khuếch đại đoạn gen lysK bằng cặp mồi biểu hiện không có sự sai lệch về trình tự gen.
Trước khi tiến hành biểu hiện, chúng tôi sử dụng trình tự đoạn gen đích đã được gắn vào vector pET32(a+) để dịch mã ra các acid amin trên cơ sở lý thuyết.
Kết quả dịch mã ( hình 4.4) cho thấy, trình tự đoạn gen đích hoàn toàn thông suốt, không xuất hiện mã kết thúc (stop codon) trong gen khi gắn vào vector pET32a(+), có mã khởi đầu và mã kết thúc, không có điểm kết thúc ở vùng khởi động, đảm bảo cho quá trình biểu hiện protein thông suốt. Vector pET32a(+) mang gen lysK được đặt tên là pETlysK. Khi so sánh đoạn gen này trên ngân hàng gen cho độ tương đồng 100% so với endolysin phage K ( KF761114.1).
1 ATG GCT AAG ACT CAA GCA GAA ATA AAT AAA CGT TTA GAT GCT TAT 45 1 Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr 15
46 GCA AAA GGA ACA GTA GAT AGC CCT TAC AGA GTT AAA AAA GCT ACA 90 16 Ala Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Val Lys Lys Ala Thr 30
91 AGT TAT GAC CCA TCA TTT GGT GTA ATG GAA GCA GGA GCC ATT GAT 135 31 Ser Tyr Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp 45
136 GCA GAT GGT TAC TAT CAC GCT CAG TGT CAA GAC CTT ATT ACA GAC 180 46 Ala Asp Gly Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp 60
181 TAT GTT TTA TGG TTA ACA GAT AAT AAA GTT AGA ACT TGG GGT AAT 225 61 Tyr Val Leu Trp Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn 75
226 GCT AAA GAC CAA ATT AAA CAG AGT TAT GGT ACT GGA TTT AAA ATA 270 76 Ala Lys Asp Gln Ile Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile 90
271 CAT GAA AAT AAA CCT TCT ACT GTA CCT AAA AAA GGT TGG ATT GCG 315 91 His Glu Asn Lys Pro Ser Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala 105
316 GTA TTT ACA TCC GGT AGT TAT GAA CAG TGG GGT CAC ATA GGT ATT 360 106 Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr Glu Gln Trp Gly His Ile Gly Ile 120
361 GTA TAT GAT GGA GGT AAT ACT TCT ACA TTT ACT ATT TTA GAG CAA 405 121 Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln 135
406 AAC TGG AAT GGT TAT GCT AAT AAA AAA CCT ACA AAA CGT GTA GAT 450 136 Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys Pro Thr Lys Arg Val Asp 150
451 AAT TAT TAC GGA TTA ACT CAC TTC ATT GAA ATA CCT GTA AAA GCA 495 151 Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu Ile Pro Val Lys Ala 165
496 GGA ACT ACT GTT AAA AAA GAA ACA GCT AAG AAA AGC GCA AGT AAA 540 166 Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Thr Ala Lys Lys Ser Ala Ser Lys 180
541 ACG CCT GCA CCT AAA AAG AAA GCA ACA CTA AAA GTT TCT AAG AAT 585 181 Thr Pro Ala Pro Lys Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val Ser Lys Asn 195
586 CAC ATT AAC TAT ACA ATG GAT AAA CGT GGT AAA AAA CCT GAA GGA 630 196 His Ile Asn Tyr Thr Met Asp Lys Arg Gly Lys Lys Pro Glu Gly 210
631 ATG GTA ATA CAC AAC GAT GCA GGT CGT TCT TCA GGA CAA CAA TAC 675 211 Met Val Ile His Asn Asp Ala Gly Arg Ser Ser Gly Gln Gln Tyr 225
676 GAG AAT TCA TTA GCT AAT GCA GGT TAT GCT AGA TAC GCT AAT GGT 720 226 Glu Asn Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Ala Arg Tyr Ala Asn Gly 240
721 ATT GCT CAT TAC TAC GGC TCT GAA GGT TAT GTA TGG GAA GCA ATA 765 241 Ile Ala His Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Val Trp Glu Ala Ile 255
766 GAT GCT AAG AAT CAA ATT GCT TGG CAC ACG GGT GAT GGA ACA GGA 810 256 Asp Ala Lys Asn Gln Ile Ala Trp His Thr Gly Asp Gly Thr Gly 270
811 GCA AAC TCA GGT AAC TTT AGA TTT GCA GGT ATT GAA GTC TGT CAA 855 271 Ala Asn Ser Gly Asn Phe Arg Phe Ala Gly Ile Glu Val Cys Gln 285
856 TCA ATG AGT GCT AGT GAT GCT CAA TTC CTT AAA AAT GAA CAA GCA 900 286 Ser Met Ser Ala Ser Asp Ala Gln Phe Leu Lys Asn Glu Gln Ala 300
901 GTA TTC CAA TTT ACA GCA GAG AAA TTT AAA GAA TGG GGT CTT ACT 945 301 Val Phe Gln Phe Thr Ala Glu Lys Phe Lys Glu Trp Gly Leu Thr 315
946 CCT AAC CGT AAA ACT GTA AGA TTG CAT ATG GAA TTT GTA CCA ACT 990 316 Pro Asn Arg Lys Thr Val Arg Leu His Met Glu Phe Val Pro Thr 330
991 GCC TGT CCT CAC CGT TCT ATG GTT CTT CAT ACA GGA TTT AAT CCA 1035 331 Ala Cys Pro His Arg Ser Met Val Leu His Thr Gly Phe Asn Pro 345
1036 GTA ACA CAA GGA AGA CCA TCA CAA GCA ATA ATG AAT AAA TTA AAA 1080 346 Val Thr Gln Gly Arg Pro Ser Gln Ala Ile Met Asn Lys Leu Lys 360
1081 GAT TAT TTC ATT AAA CAA ATT AAA AAC TAC ATG GAT AAA GGA ACT 1125 361 Asp Tyr Phe Ile Lys Gln Ile Lys Asn Tyr Met Asp Lys Gly Thr 375
1126 TCA AGT TCT ACA GTA GTT AAA GAT GGT AAA ACA AGT AGC GCA AGT 1170 376 Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp Gly Lys Thr Ser Ser Ala Ser 390
1171 ACA CCG GCA ACT AGA CCA GTT ACA GGT TCT TGG AAA AAG AAC CAG 1215 391 Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser Trp Lys Lys Asn Gln 405
1216 TAC GGA ACT TGG TAT AAA CCG GAA AAT GCA ACA TTT GTC AAT GGT 1260 406 Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala Thr Phe Val Asn Gly 420
1261 AAC CAA CCT ATA GTA ACT AGA ATA GGT TCT CCA TTC TTA AAT GCT 1305 421 Asn Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe Leu Asn Ala 435
1306 CCA GTA GGC GGT AAC TTA CCG GCA GGG GCT ACA ATT GTA TAT GAC 1350 436 Pro Val Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val Tyr Asp 450
1351 GAA GTT TGT ATC CAA GCA GGT CAC ATT TGG ATA GGT TAT AAT GCT 1395 451 Glu Val Cys Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn Ala 465
1396 TAC AAC GGT AAC AGA GTA TAT TGC CCT GTT AGA ACT TGT CAA GGT 1440 466 Tyr Asn Gly Asn Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly 480
1441 GTT CCA CCT AAT CAA ATA CCT GGC GTT GCC TGG GGA GTA TTC AAA 1485 481 Val Pro Pro Asn Gln Ile Pro Gly Val Ala Trp Gly Val Phe Lys 495
1486 TAG 1488 496 stop 496
Hình 4.3: Trình tự nucleotide và acid amin suy diễn từ gen lysK mã hóa lysin