2.1. Mẫu thực vật
2.1.1. Mẫu nghiên cứu th nh phần hóa học
Cây củ gấu (Cyperus rotundus L.) đƣợc thu hái tại Đông Anh, Hà Nội vào tháng 9/2011 và cây củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) đƣợc thu hái tại Tiền Hải, Thái Bình vào tháng 6/2011. Các mẫu thực vật đƣợc giám định bởi PGS.TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật. Các mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hoạt chất Sinh học, Viện Hoá Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hình 2.1. Mẫu tiêu bản thực vật cây củ gấu (Cyperus rotundus L.)
Hình 2.2. Mẫu tiêu bản thực vật cây củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) 2.1.2 Mẫu nghiên cứu dấu vân tay sắc ký
Mẫu nghiên cứu dấu vân tay sắc ký bao gồm 06 mẫu củ gấu, 06 mẫu củ gấu biển và 04 mẫu dược liệu Hương phụ được thu thập vào tháng 3 năm 2015 từ các địa điểm khác nhau.
Bảng 2.1. Địa điểm thu thập mẫu nghiên cứu STT Ký
hiệu Đối tƣợng Địa điểm thu thập mẫu
1 CGV1 Củ gấu (C. rotundus L) Đồng Văn, Yên Lạc, Vĩnh Phúc, mọc trên đất.
2 CGV2 Củ gấu (C. rotundus L) Mỹ Độ, Tp.Bắc Giang, Bắc Giang, mọc trên đất.
3 CGV3 Củ gấu (C. rotundus L) Mỹ Độ, Tp.Bắc Giang, Bắc Giang, mọc trên cát.
4 CGV4 Củ gấu (C. rotundus L) Đồng Châu, Tiền Hải, Thái Bình, mọc trên đất.
5 CGV5 Củ gấu (C. rotundus L) Kim Đông, Kim Sơn, Ninh ình, mọc trên đất.
6 CGV6 Củ gấu (C. rotundus L) Nghi Sơn, Tĩnh Gia, Thanh Hóa, mọc trên đất.
- 37-
STT Ký
hiệu Đối tƣợng Địa điểm thu thập mẫu
7 CGB1 Củ gấu biển
(C. stoloniferus Retz.)
Đông Hải, Hải An, Hải Phòng, mọc trên cát, lần 1.
8 CGB2 Củ gấu biển
(C. stoloniferus Retz.) Đồng Châu, Tiền Hải, Thái Bình, mọc trên đất.
9 CGB3 Củ gấu biển
(C. stoloniferus Retz.) Đồng Châu, Tiền Hải, Thái Bình, mọc trên cát.
10 CGB4 Củ gấu biển
(C. stoloniferus Retz.) Quất Lâm, Giao Thủy, Nam Định, mọc trên cát.
11 CGB5 Củ gấu biển
(C. stoloniferus Retz.) Kim Đông, Kim Sơn, Ninh ình, mọc trên cát.
12 CGB6 Củ gấu biển
(C. stoloniferus Retz.)
Đông Hải, Hải An, Hải Phòng, mọc trên cát, lần 2 (sau lần 1 02 tuần).
13 HP1 Dược liệu Hương phụ Tp.Nam Định.
14 HP2 Dược liệu Hương phụ Tp.Thái Bình.
15 HP3 Dược liệu Hương phụ Phố Lãn Ông – Hà Nội.
16 HP4 Dược liệu Hương phụ Phố Nguyễn Bỉnh Khiêm - Hà Nội.
Ghi chú: Các mẫu dược liệu Hương phụ được mua tại các nhà thuốc Đông y, đây là các dược liệu đã đƣợc chế biến nhƣng không rõ nguồn gốc, xuất xứ nơi trồng.
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.1. Phương pháp ngâm chiết
Mẫu thân rễ củ gấu và củ gấu biển đƣợc sơ chế loại lá, rễ con, đất rồi đƣợc phơi khô trong bóng râm sau đó đƣợc xay nhỏ, chiết siêu âm với methanol. Dịch chiết gom lại và cô cạn dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hoà với nước rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexane hoặc chloroform và ethyl acetate thu được các cặn chiết n-hexane hoặc chloroform tương ứng, cặn chiết ethyl acetate và cặn nước. Để phân tách các phần cặn chiết, phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (dùng để khảo sát), sắc ký cột.
2.2.2. Sắc ký ớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 và RP-18 F254 (Merck-Đức). Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi hơ nóng từ từ cho đến khi hiện màu.
Header Page 50 of 148.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với pha tĩnh là pha thường (Silica gel 60, 0,04- 0,06mm, Merck) hoặc pha đảo YMC-RP-18 (Fujisilisa-Nhật Bản), nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind. Co., Ltd.), Sephadex LH-20.
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy đƣợc xác định bằng máy Mel-Temp 3.0 (Thermo Scientific) của Viện Hoá Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.2. Độ quay cực ([α]D)
Độ quay cực đƣợc đo trên máy JASCO P2000 Polarimeter của Viện Hoá Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.3. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại đƣợc đo trên máy Tensor 37 FT-IR spectrometer (Bruker, Ettlingen, Germany) của Viện Hoá Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.4. Phổ ƣỡng sắc tròn (CD)
Phổ lƣỡng sắc tròn đƣợc đo trên máy J-810 CD Spectropolarimeter (JASCO, Nhật Bản) của trường ĐH Korea, Hàn Quốc.
2.3.5. Phổ khối ƣợng (MS)
Phổ khối lƣợng phun mù điện tử ESI-MS đƣợc đo trên hệ máy AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap của Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AGILENT 6120 Single Quadrupole LC/MS của Viện Hoá Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS đƣợc đo trên hệ máy API Q-STAR PULSAR I (Applied BioSystems, USA) của Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Quốc gia, Paris, Pháp.
2.3.6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR đƣợc ghi bằng máy BRUKER AVANCE 500 MHz của Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
- 39-
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY, NOESY.
Dung môi đƣợc sử dụng bao gồm các dung môi: DMSO-d6, CD3OD, CDCl3, acetone-d6. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử.
2.4. Phương pháp xây dựng dấu vân tay sắc ký 2.4.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu
Mẫu thân rễ củ gấu và củ gấu biển đƣợc sơ chế loại lá, rễ con, đất rồi đƣợc phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở nhiệt độ 40 oC đến khối lƣợng không đổi. Các mẫu này cùng với mẫu dược liệu Hương phụ được nghiền nhỏ, cân chính xác khoảng 5,00 g, chiết siêu âm với methanol 3 lần. Dịch chiết đƣợc gom lại và cô bớt dung môi dưới áp suất giảm và định mức bằng methanol để tiến hành sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và phân tích trên sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2.4.2. Sắc ký ớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn HPTLC silica gel 60 F254 (Merck-Đức). Các vết chất đƣợc phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, sử dụng thuốc thử AlCl3 3 % trong ethanol.
Thiết bị sử dụng là bộ chấm bản mỏng Linomat V, buồng triển khai đáy kép, và bộ chụp ảnh CAMAG TLC scanner III của Viện Dƣợc liệu.
2.4.3. Sắc ký ỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc đo trên hệ máy AGILENT 1260 series với detector DAD (Diode Array Detector) và detector MS của Viện Hoá Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Header Page 52 of 148.