Phần 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.4 Kết quả nghiên cứu vi khuẩn
3.4.1 Kết quả nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn
Nghiên cứu đã phân lập được 23 chủng vi khuẩn từ các cơ quan khác nhau (gan, thận, lách, mắt, não) của của 15 cá thể bệnh. Trên môi trường TCBS thu được 2 nhóm: nhóm khuẩn lạc màu vàng do có khả năng phân giải đường Sacarose và nhóm khuẩn lạc màu xanh do vi khuẩn không có khả năng phân giải sacarose. Trên môi trường TSA thu được 2 dạng khuẩn lạc màu vàng nhạt: một dạng lồi, bề mặt ráo, mép tròn,đường kính 2-2.5 mm; một dạng khuẩn lạc dẹt, viền mép trong, tròn, đường kính 1-2 mm.
Hình 3.8: Goezia sp
Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy, lưu giữ và thực hiện các phản ứng sinh hóa, kết quả định danh được 5 loài vi khuẩn thuộc 3 giống, trong đó có 3 loài thuộc giốngVibrio, 1 loài thuộc giốngAeromonas, và 1 loài thuộcAncinetobacter.
Một số đặc điểm cơ bản của các giống vi khuẩn:
Vi khuẩn Vibrio sp: Gram âm, hình que ngắn thẳng hoặc hơi cong, có khả năng di động, phản ứng oxidase dương tính, có khả năng lên men và oxi hóa trong mụi trường O/F Glucose, khụng sinh H2S, mẫn cảm với thuốc thử 0/129 (150àg).
Vi khuẩn Aeromonas sp: Gram âm, hình que ngắn, phản ứng oxidase dương tính, có khả năng khử Nitrate và lên men các đường: Saccarose, glucose, manitol, cú khả năng sinh hơi và sinh H2S, khỏng thuốc thử 0/129 (150àg).
Ancinetobacter sp: Gram âm, oxidase âm tính, catalase dương tính, có khả năng khử Nitrate, phản ứng ure dương tính, có khả năng oxi hóa nhưng không có khả năng lên men trong môi trường O/F Glucose, hầu hết các phản ứng khác đều âm tính.
Đặc điểm hình thái, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được thể hiện trong bảng3.4.
Kít định danh vi khuẩn API-20E
PP định danh vi khuẩntruyền thống
Nhuộm Gram Khuẩn lạc trên môi trường TSA
Khuẩn lạc xanh trên môi trường TCBS Khuẩn lạc vàng trên môi trường TCBS
Hình 3.9: Một số hìnhảnh phân lập và định danh vi khuẩn
Bảng3.4: Kết quả phản ứng sinh hóa và định danh vi khuẩn
V.damselab (1) Aeromonas spa (2) Acinetobacter calcoaceticusa (3) V.haveya (4) Vibriospa (5)
NhuộmGram Oxidase Catalase
Mọc trên TCBS 0/129:150àg Nồng độ muối:
0%
3%
5%
7%
10%
Nitrate Citrate OF Mannitol KIA:
Glucose Lactose H2S Gas Indol Di động Gelatine
- V + G S
- + + V - + - +/+
+
+ - - + - + -
- + + Y R
+ + + + - + + +/+
+
+ - V
+ V + +
- - + NG
S
+ + + + - + - +/-
-
- - - - + + -
- + + Y/G
S
+ + + + + + + +/+
+
+ - - - + + +
- + - Y
S
- + + + - + + +/+
+
+ - - - + + -
Decarboxylase:
Arginine Lysine Ornithine Methyl red
Voges-Proskauer Urease
ONPG TDA MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
(1)
+ + - + . V
- + - - - - - - - -
(2)
- + - + . - - - + - - - + - + -
(3)
- - - - . +
(4)
V + + + . -
(5)
+ - - + . -
Ghi chú: a: dựa theo tài liệu của G.Nicolas Frerichs (1993). [27]
b: dựa theo tài liệu của Jean F, Mac Eaddin (1980). [31]
Từ kết quả phân lập định danh vi khuẩn, đề tài tiến hành đánh giá tần số bắt gặp các chủng vi khuẩn đã phân lập.Kết quả trình bày qua bảng 3.5.
Bảng 3.5: Tần số bắt gặp các chủng vi khuẩn
Vi khuẩn Số mẫu(n=15) Tần số (%)
V.damsela Aeromonas sp
Ancinetobacter calcoaceticus V.havey
Vibrio sp
15 11 3 2 2
100 73.3
20 13.3 13.3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
V.damsela
Aeromonas sp
Ancinetobacter sp
V.harvey
Vibrio sp
Loài
Tần số(%)
Hình 3.10: Biểu đồ tần số bắt gặp cácchủng vi khuẩn phân lập
Kết quả phân lập định danh vi khuẩn cho thấy, các loài thuộc giống Vibrio chiếm đa số trong các chủng vi khuẩn phân lập. Đây là giống vi khuẩn đặc trưng cho vi khuẩn vùng biển nhiệt đới, gồm nhiều loài như: V.harveyi, V.vulniticus, V.parahaemolyticus, V.anginolyticus, V.anguilarum, V.damsela, V.cholerae… gây bệnh trên nhiều loài ĐVTS nước lợ, mặn. [6]
Qua biểu đồ trên ta thấy, V.damsela và Aeromonas sp là 2 loài vi khuẩn có tần số bắt gặp cao trong các mẫu bệnh phẩm đã phân tích (100% và 73.3%), các vi khuẩn khác cao tần số gặp thấp hơn và phân tán.
Milton và cs (1981)đã phân lậpV.damsela từ những vết loét trên da của loài cá Damselfish nhiệt đới (Chromis punctipinnis). Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ngược V.damsela trên loài cá này cũng cho thấy sự xuất hiện dấu hiệu
bệnh lý tương tự ngoài tự nhiên với những vết loét có đường kính từ 0.5- 2 cm, thường ở gần gốc vây ngực và gần cuống đuôi. Các vết loét này xuất hiện chỉ sau khi cảm nhiễm 3 ngày và gây chết cá trong vòng 4 ngày. Thí nghiệm cũng cho thấy V.damsela là tác nhân gây bệnh trên 4 loài Damselfish nữa nhưng không không gây bệnh ở những họ cá khác. Theo Hastein và cs (2005) V.damsela cũng là tác nhân gây bệnh Pasteurellosis ở cá chẽm trắng. Ở nước ta, Đỗ Thị Hòa và cs (2007) đã phân lập được vi khuẩn này (Photobacterium damsela) trên cá giò bị bệnh đốm trắng ở thận với các dấu hiệu như kém ăn, chậm lớn, giải phẫu bên trong cơ thể biểu hiện thận bị sưng, xuất hiện các đốm trắng dạng hạt trong mô thận, đôi khi gặp ở gan và tụy và gây chết cá rải rác. Tuy nhiên, các dấu hiệu bệnh lý trên cá thia đồng tiền ba chấm đã phân tích chủ yếu là lồi mắt, mòn cụt vây, chấm đen gan và một số dấu hiệu xuất hiện rải rác như xuất huyết da, xuất huyết bóng hơi…không có những dấu hiệu như đã mô tả trong cácnghiên cứu trên. [36], [29], [7].
Mặt khác, chưa tìm thấy thông báo nào về tác động của V.damsela trên D.trimaculatus song đây cũng là loài cá thuộc Damselfish nên việc cảm nhiễm và bị ảnh hưởng của vi khuẩn này là rất có thể.
Cipriano (2001) đã miêu tả về bệnh nhiễm khuẩn doAeromonasdi động ở cá với các dấu hiệu như: lở loét, mòn vây cụt duôi, lồi mắt, rụng vẩy, xuất huyết.
Trường hợp cấp tính cá có thể chết nhanh chỉ trong một vài ngày mà không thể hiện rõ dấu hiệu bệnh lý. Tác giả cũng đưa ra một số nghiên cứu khác về các bệnh cá có dấu hiệu tương tự như: Yambot và Inglis (1994) đã mô tả tình trạng bệnh cấp tính trên cá rô phi (Tilaphia) với các dấu hiệu như một hoặc hai mắt mờ đục, mắt lồi, dẫn đến nổ mắt, cuối cùng cá bị mù và chết; các loài thuộc Aeromonasdi động đãđược phân lập từ mắt, gan, thận của cá bệnh. Ogara và cs (1998) cũng đã thông báo tình trạng nhiễm khuẩn doAeromonas di động gây tỷ lệ chết cao trên cá hồi cầu vồng với những dấu hiệu bệnh lý tương tự. Có thể thấy những dấu hiệu bệnh lý ở mắt được mô tả trong các nghiên cứu này rất giống với hiện tượng mắt lồi ở các mẫu cá thia đồng tiền ba chấm đã phân tích.
Mặc dù Aeromonas vốn được biết đến là tác nhân gây bệnh phổ biến trên cá nước ngọt nhưng cũng đã có nhiều nghiên cứu phân lập được giống này trên cá và các động vật nước mặn. Do vậy mà khả năng gây bệnh của Aeromonas trên cá biển là không thể loại trừ. [39]
Năm 1978, một đợt bùng phát bệnh đã làm chết hàng loạt cá hồi đại tây dương cỡ 5-10 kgở vùng cửa sông Surma, Norway với tỷ lệ chết tích lũy lên tới 92% trong vòng 5 tuần và chỉ 40% thể hiện dấu hiệu bệnh lý: sung huyết ở các mạch máu dưới da, phù nề biểu bì vùng gần gốc vây dẫn tới lở loét, xuất hiện những tổn thương ở gan, thận, lách và những đốm xuất huyết nhỏ ở bóng hơi và màng bụng. Rould và Hastein (1980) đã phân lập chủng vi khuẩn Ancinetobacter từ những mẫu cá hồi này (trích theo B.Austin và D.A.Austin) . Cũng theo tài liệu này, Ancinetobacter sp được xem là tác nhân gây bệnh Ancinetobacteriosis trên cá cá hồi đại tây dương (Atlantic salmon) và cá nheo (Channel catfish) ở Nauy và Mỹ. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu vi khuẩn trên các mẫu cá bị ảnh hưởng của hội chứng lở loét Epizootic Ulcerative Syndrome (EUS) của N.Thampuran và cs (1995) đã phân lập được Acinetobacter calcoaceticus với tỷ lệ cảm nhiễm33%.
[21], [40]
Tuy nhiên, nghiên cứu mới chỉ dừng ở phân lập, định danh vi khuẩn trên các mẫu cá bệnh, chưa đi sâu tìm hiểu để có thể đánh giá khả năng gây bệnh của các vi khuẩn này trên cá thia đồng tiền ba chấm (D.trimaculatus).