4.1. Xác định độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của OS35 trên động vật thực nghiệm
4.1.1. Xác định độc tính cấp của OS35 theo đường uống trên chuột nhắt trắng
Động vật thường được sử dụng loài gặm nhấm với đường dùng thường là đường dùng dự kiến sử dụng trên người [111]. Trong nghiên cứu độc tính cấp, mỗi động vật thực nghiệm được dùng thuốc trong 24 giờ, sau đó quan sát trong 1 tuần để xác định các triệu chứng độc (nếu có). Một số nghiên cứu độc
tính cấp được thiết kế để xác định LD50 của thuốc thử. LD50 được định nghĩa là liều gây chết 50% số động vật thực nghiệm [111],[112].
Kết quả từ nghiên cứu độc tính cấp và LD50 có thể được dùng cho các mục đích như sau [112]:
- Làm cơ sở ban đầu để phân loại các chất hoặc thuốc thử về độc tính.
- Định hướng xác định liều trong các nghiên cứu tiếp theo bao gồm cả nghiên cứu độc tính dài hạn và nghiên cứu tác dụng dược lý.
- Xác định bước đầu cơ quan đích có thể bị độc bởi thuốc thử cũng như sơ bộ xác định cơ chế gây độc, từ đó định hướng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo như nghiên cứu độc tính bán trường diễn hoặc các độc tính trên cơ quan riêng biệt.
Nghiên cứu này đánh giá độc tính cấp của OS35 trên chuột nhắt trắng khi dùng đường uống theo phương pháp Litchfield Wilcoxon [103],[104].
Kết quả cho thấy những lô chuột uống chế phẩm OS35 liều từ 1,25 g/kg thể trọng chuột trở lên có xuất hiện hiện tượng chuột chết. Từ tỉ lệ % chuột chết tương ứng với liều OS35 cho uống, xác định được LD50 của OS35 theo đường uống trên chuột nhắt trắng là 4,5 (2,8 - 7,1) g/kg với p = 0,05.
Theo Hệ thống Hòa hợp Toàn cầu (GHS), dựa vào giá trị LD50 có thể phân loại các chất thành 5 nhóm như trình bày ở bảng 4.1 [110]. Như vậy, theo bảng phân loại của GHS, OS35 được xếp vào Nhóm 5. Cũng theo GHS, các chất được xếp vào nhóm 5 là những chất có độc tính cấp tương đối thấp, tuy nhiên, trong một số trường hợp nhất định, các chất này có thể gây tổn thương cho các đối tượng nhạy cảm. Một nghiên cứu được tiến hành năm 2013 về độc tính cấp của osthol trên chuột nhắt trắng theo đường uống cũng xác định được LD50 của osthol là 3,45 (3,03 – 4,03) g/kg với p = 0,05 [113].
Theo kết quả này, thuốc thử cũng được xếp vào Nhóm 5 theo phân loại của GHS.
Bảng 4.1. Phân loại các chất dùng đường uống dựa vào LD50 theo GHS [110]
Giá trị LD50
Phân loại theo
GHS
Thông tin bắt buộc ghi trên nhãn
≤ 5 mg/kg Nhóm 1 NGUY HIỂM
Đe dọa tính mạng nếu nuốt phải
> 5 mg/kg và ≤ 50 mg/kg Nhóm 2
> 50 mg/kg và ≤ 300 mg/kg Nhóm 3 NGUY HIỂM
Gây độc nếu nuốt phải
> 300 mg/kg và ≤ 2000 mg/kg Nhóm 4 CẢNH BÁO
Gây hại nếu nuốt phải
> 2000 mg/kg và ≤ 5000 mg/kg Nhóm 5 CẢNH BÁO
Có thể gây hại nếu nuốt phải
> 5000 mg/kg Không
phân loại
Không yêu cầu cảnh báo đặc biệt
Liều dùng của OS35 có tác dụng dược lý được sử dụng trong luận án này là 150 mg/kg ở chuột cống và 60 mg/kg ở thỏ; tương ứng với 20 mg/kg ở người; ngoại suy ra liều ở chuột nhắt là 240 mg/kg. Liều bắt đầu có tác dụng dược lý bằng 1/5 liều bắt đầu gây chết chuột (1,25 g) và bằng 1/62,5 liều chết 100% chuột. So với LD50, liều có tác dụng dược lý bằng 1/18,75. Theo Đỗ Trung Đàm, liều có tác dụng dược lý dao động trong giới hạn 1/20 đến 1/5 LD50 [104].
Trong nghiên cứu độc tính cấp, ngoài việc xác định LD50, các nhà nghiên cứu còn có mục đích khác là xác định bước đầu cơ quan nào có thể bị gây độc bởi thuốc thử và sơ bộ xác định cơ chế gây độc của thuốc thử đó.
Trong nghiên cứu độc tính cấp của OS35, các triệu chứng độc tính cấp ở các lô có chuột chết như sau: sau khi uống, chuột ở tình trạng chậm chạp, ức chế, nằm im, không ăn uống gì. Sau 30 phút, chuột chuyển sang trạng thái khó thở,
vã bọt mép rồi dẫn đến suy hô hấp, tím vùng đầu và cổ, co giật rồi chết. Các chuột đều chết trong vòng 24 giờ sau khi uống thuốc thử. Khi mổ các chuột chết để quan sát đại thể thì quan sát thấy hiện tượng sung huyết ở tim, phổi, gan của chuột.
Một số nghiên cứu cho thấy osthol có tác dụng đối kháng kênh calci trên tế bào cơ trơn mạch máu và tăng lượng GMP vòng ở tế bào cơ trơn mạch vành [60],[61]. Khi dùng với liều cao trong nghiên cứu độc tính cấp, OS35 có tác dụng giãn mạch quá mức. Lý giải này phù hợp với tình trạng sung huyết phổi, tim, gan khi mổ và quan sát đại thể các chuột chết.
Ở các chuột chết còn quan sát thấy hiện tượng co giật. Tuy nhiên, hiện tượng co giật này có vẻ không phải do tác dụng kích thích thần kinh trung ương của OS35. Lí do là sau khi uống thuốc, chuột không có tình trạng kích thích mà trái lại nằm im, chậm chạp, ức chế, không đi lại, ăn uống gì. Nghiên cứu của Zhou Qing (1998) và J.Singhuber (2009) cho thấy osthol có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, có thể do cơ chế điều biến trên receptor của chất dẫn truyền thần kinh gamma-aminobutyric (GABA), làm tăng khả năng gắn của GABA vào receptor và làm tăng tác dụng của GABA [63],[64]. Các kết quả này phù hợp với triệu chứng của chuột nhắt sau khi uống OS35. Đến nay, chưa tìm thấy có nghiên cứu nào về tác dụng kích thích thần kinh trung ương của osthol hay quả Xà sàng. Có thể, do tác dụng của osthol trên kênh calci và GMP vòng, dẫn đến tình trạng giãn mạch toàn thân, trong đó có mạch não, gây ra tình trạng tăng áp lực nội sọ và gây ra triệu chứng co giật trên chuột.
Với những giả thuyết về cơ quan đích và cơ chế gây độc của OS35, khi sử dụng OS35 cho bệnh nhân trên lâm sàng cần chú ý đến những tác dụng không mong muốn gây ra do tình trạng giãn mạch và ức chế thần kinh trung ương.