Chương 2. Tìm hiểu chung về HSP
2.7. Định lượng tương tác giữa HSP và peptid
Mục đích: Biết được bao nhiêu peptid bị ràng buộc với HSP70 liên quan đến vấn đề quan trọng là có bao nhiêu kháng nguyên tạo phức hợp với HSP, cần được phân phối đến APC để tạo ra miễn dịch, nghĩa là nó nằm trong phạm vi "sinh lý" hay là "dược lý"?
Hơn nữa, định lượng tương tác HSP-peptid cho phép so sánh hiệu quả tương đối của các dạng phức hợp HSP-kháng nguyên khác nhau, cả về các nghiên cứu dược lý và tối ưu hóa thiết kế vaccin.
Phương pháp:
Tương tác HSP-peptid đã được nghiên cứu bằng việc sử dụng các chất peptid huỳnh quang nhạy cảm với môi trường, dị hướng huỳnh quang, peptid phóng xạ và huỳnh quang tryptophan. Những kỹ thuật này đã được sử dụng để định lượng sự phân bố của kháng nguyên bởi các HSP, mặc dù bản chất cực kỳ kị nước của nhiều peptid kháng nguyên so với các peptid gắn kết HSP "mô hình". Các nghiên cứu ban đầu sử dụng các peptid được gắn chất phóng xạ hoặc huỳnh quang và cả gel điện di hoặc sắc ký để tách peptid tự do khỏi peptid gắn kết với HSP và được thực hiện trong điều kiện nồng độ peptid vượt quá nồng độ HSP. Những điều kiện này ủng hộ sự gắn kết peptid tối đa, và 1-30% HSP đã được tìm thấy được nạp với peptid. Bởi vì các điều kiện thực nghiệm đã tạo thuận lợi cho việc nạp peptid của HSP nên những nghiên cứu này cho thấy tương tác yếu bởi vì hầu hết, 1/3 các phân tử HSP đã bị chiếm bởi kháng nguyên.
Tuy nhiên, sự tương tác giữa HSP-peptid không được định lượng và lượng kháng nguyên nhỏ nhất cần thiết cho phản ứng miễn dịch cũng không được định lượng.
Sự cộng hưởng plasmon bề mặt đã được sử dụng để mô tả cả về chất lượng và số lượng sự gắn kết peptid với HSP70. Tại nồng độ 1 nM, ái lực của peptid NRLLLTG cao hơn nhiều lần so với trước đây và có thể là do sự gắn kết trong pha rắn của peptid trong sự cộng hưởng plasmon bề mặt, kết quả là sự đánh giá quá cao ái lực so với phương pháp ở pha dung dịch.
Các nghiên cứu tiếp theo sử dụng kỹ thuật huỳnh quang để định lượng tương tác HSP-kháng nguyên. Sử dụng phép không đẳng hướng (dị hướng) huỳnh quang chúng tôi xác định ái lực cân bằng của HSP70 đối với các peptid kháng nguyên nằm trong khoảng 1-12 μM và thấy rằng nồng độ picomolar của phức hợp HSP70-peptid mycobacterial đủ để tạo ra phản ứng CTL (lympho bào T độc tế bào ) invitro [57]. Những dữ liệu này cho thấy việc tạo ra CTL bằng cách trình bày chéo của HSP-peptid có thể đạt được bằng các nồng độ sinh lý của kháng nguyên. HSP70 mycobacterial đột biến, với sự thay thế acid amin trong các liên kết peptid khiếm khuyết, liên kết peptid suy yếu và do đó cho phép hai chức năng miễn dịch của HSP70, kích thích miễn dịch bẩm sinh và kích thích miễn dịch đáp ứng được tách ra.
Tối ưu hóa sự gắn kết peptid với các HSPs cung cấp một chiến lược thú vị để nâng cao hiệu quả tạo ra phản ứng miễn dịch. Fletchner và cộng sự đã thiết kế ra các peptid kháng nguyên lai với hai lần điều chỉnh ở đầu N của chuỗi peptid " javelin". Dư lượng acid amin (ví dụ, NRLLLTG) liên kết với HSP70, được theo sau bởi một vùng liên kết được dự đoán là sẽ làm tăng sự phân tách proteasomal và protease và, có lẽ, sự sẵn có của epitop kháng nguyên để trình bày chéo. Sử dụng các peptid kháng nguyên
“javelin” mà đã được sửa đổi đã cải tiến ái lực của các epitop cho HSP về độ lớn. Mặc dù ái lực của các epitop với HSP70 rất khác nhau, dao động từ 40 đến 2500 μM, ái lực của các epitop mà được sửa đổi , tất cả đều trong một phạm vi độ lớn (~ 1 μM) [23]. Ưu điểm của phương pháp này là nó tạo điều kiện cho việc kết hợp nhiều epitop kháng nguyên khác nhau vào HSP70. Cách tiếp cận này kết hợp dữ liệu cấu trúc và sinh hóa để tối ưu hóa thiết kế kháng nguyên và định lượng hiệu quả của đáp ứng miễn dịch cung cấp một bước tiến tiềm ẩn đáng kể trong việc thiết kế vắc xin HSP.
27
Hình 2.7: Sơ đồ sự dị hướng huỳnh quang để tính tương quan HSP-peptid [57]
(A) Khi một chất peptit huỳnh quang (hình tròn) bị kích thích bởi ánh sáng tới phân cực, sự suy giảm nhanh của chất huỳnh quang trong suốt thời gian trạng thái kích thích huỳnh quang, dẫn đến sự khử cực một phần của ánh sáng huỳnh quang phát ra.
(B) Việc gắn kết peptid với phối tử của nó, HSP70 (hình vuông), kết quả là giảm bớt tốc độ và do đó giảm sự khử cực của huỳnh quang phát ra. Điều này được đo bằng sự tăng bất đẳng hướng. Sự tăng bất đẳng hướng đối với các nồng độ HSP70 khác nhau cho phép tính toán ái lực HSP-peptid.