Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 Phương pháp nghiên cứu
24
3.5.2 Quy trình thủy phân sụn ức gà bằng enzyme papain
25
♦♦♦ Thuyết minh quy trình
■ Lựa chọn nguyên liệu sụn ÚC gà
- Mục đích: Đảm bảo nguyên liệu mang tính đồng nhất để dùng ửong nghiên cứu.
- Thực hiện: Nguyên liệu được mua tại Công ty TNHH Phạm Tôn, cùng một giống gà và cùng một lứa (thường từ 38 ngày tuổi đến 42 ngày tuổi).
Nguyên liệu được giết mổ trong ngày, còn tươi, không có mùi lạ.
- Yếu tố khảo sát: Thời gian bảo quản nguyên liệu.
■ Làm sạch
- Mục đích: Tách phần xương với phần sụn ức, loại đi các bụi bẩn còn bám ửên bề mặt.
- Thực hiện: Xương ức gà sau khi được mua về sẽ được tách lấy phần sụn ức. Sụn này sẽ được rửa qua nước muối 5%, làm ráo và cho vào túi PE, hàn kín; đem bảo quản ở nhiệt độ -18°c cho đến khi sử dụng.
■ Xử lý nhiệt
- Mục đích: Giúp tách phần mô và mỡ ra khỏi sụn dễ dàng ở công đoạn sau, đồng thời làm mềm sụn tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nghiền.
- Thực hiện: Sụn được cho vào nước và gia nhiệt lên. Lượng sụn và lượng nước ở mỗi thí nghiệm là như nhau để đảm bảo tính đồng đều của nguyên liệu.
- Yếu tố khảo sát: Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn và thời gian xử lý nhiệt sụn.
26
■ Xử lý sụn
- Mục đích: Tách bỏ phần mô và mỡ còn bám ửên sụn, đồng thời loại bỏ phần xương còn sót lại trên sụn. Giúp chuẩn bị nguyên liệu cho công đoạn sau.
- Thực hiện: Dùng dao cạo sạch thịt, màng protein và mỡ bao quanh sụn, để ráo.
■ Nghiền
- Mục đích: Làm giảm kích thước của sụn nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa sụn với enzyme, tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme hoạt động dễ dàng hơn.
- Thực hiện: Sụn được nghiền bằng máy xay sinh tố. Khối lượng sụn là 15 g và tốc độ xay ở mỗi nghiệm thức của thí nghiệm được giữ cố định.
- Yếu tố khảo sát: Thời gian nghiền sụn.
■ Thủy phân
- Mục đích: Trích ly GAGs có trong sụn ức gà.
- Thực hiện: Sụn được cho vào dung dịch đệm đã chỉnh pH, bổ sung enzyme. Quá trình thủy phân được thực hiện trong bể điều nhiệt có kết hợp lắc đảo 120 vòng/phút nhằm tăng khả năng tương tác giữa enzyme và sụn cho quá trình thủy phân hiệu quả hơn.
- Các yếu tố khảo sát: Tỷ lệ sụn:đệm, pH, hàm lượng E/S, nhiệt độ và thời gian thủy phân.
■ Vô hoạt enzyme
- Mục đích: Kìm hãm hoạt động của enzyme để tránh các biến đổi về sau quá trình thủy phân.
- Thực hiện: Đun cách thủy mẫu thủy phân ở nhiệt độ 90°C trong 10 phút, sau đó đem làm nguội.
■ Kết tủa 1
- Mục đích: Kết tủa các protein còn sót lại ửong mẫu, nhằm tăng độ tinh sạch cho chế phẩm GAGs.
- Thực hiện: Hòa tan acid trichloroacetic (TCA) vào dịch sau thủy phân,
27
để qua đêm ở nhiệt độ 10°C.
- Yếu tố khảo sát: Hàm lượng TCA.
■ Lọc
- Mục đích: Loại bỏ phần protein sau khi kết tủa bằng TCA, thu phần dịch trong.
- Thực hiện: Tiến hành lọc chân không mẫu sau khi tủa TCA qua đêm, sử dụng giấy lọc với kích thước lỗ 20 pm đến 25 pm.
■ Thẩm tích
- Mục đích: Loại bỏ những tạp chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn 14 kDa ra khỏi mẫu như TCA, các acid amine, muối khoáng, ...
- Thực hiện: Cho dịch mẫu vào túi cellophane, có kích thước lỗ màng 14 kDa, đường kính màng là 44 mm. Sau đó cho mẫu vào cốc nước cất để thẩm tích 4 giờ, định kỳ thay nước 30 phút/lần.
■ Kết tủa 2
- Mục đích: Kết tủa GAGs có trong dịch mẫu sau khi thẩm tích.
- Thực hiện: Cho dịch sau khi thẩm tích vào ethanol 96% với tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol khảo sát, để mẫu qua đêm ở nhiệt độ 10°C.
- Yếu tố khảo sát: Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol.
■ Sấy
- Mục đích: Loại bỏ phần nước và ethanol đã bổ sung vào mẫu. Làm khô tủa, thu nhận thành phẩm GAGs; giúp thuận tiện cho quá trình bảo quản.
- Thực hiện: Gạn bớt phần nước và ethanol ở phía trên, tách phần tủa bên dưới đem sấy ở nhiệt độ 60°C và thu GAGs khô.
3.3.3 Phương pháp bể trí thi nghiệm
■ Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của quá trình xử lý nhiệt sụn ức gà đến hàm lượng GAGs.
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất, từ đỗ chọn được nhiệt độ của quá trình xử lý nhiệt sụn để tiến hành các thí nghiệm sau.
28
Bảng 3.1: Điều kiện thí nghiệm 1
[19]
[19]
pH 7,0 [19], [20], [45]
Hàm lượng E/S (%w/wpro) 0,4 [19], [45], [46]
Nhiệt độ thủy phân (°C) 65 [19], [20]
Thời gian thủy phân (phứt)
180 [20]
Hàm lượng TCA (%) 7 [19], [41], [46], [47]
Thời gian thui m tích (giờ) 4
29
" Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng thòi gian quá trình xử lý nhiệt sụn ức gà đến hàm lượng GAGs.
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất, từ đó chọn được thời gian của quá trình xử lý nhiệt sụn để tiến hành các thí nghiệm sau.
Bảng 3.2: Điều kiện thí nghiệm 2
[19]
pH 7,0 [19], [20], [45]
Hàm lượng E/S (%w/wpro) 0,4 [19], [45], [46]
Nhiệt độ thủy phân (°C) 65 [19], [20]
Thời gian thủy phân (phút)
180 [20]
Hàm lượng TCA (%) 7 [19], [41], [46], [47]
" Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình xử lý nhiệt sụn ức gà.
Để xác định được các kết quả tối ưu từ các thí nghiệm tương tác của các yếu tố đến hàm mục tiêu, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) và phần mềm Modde 5.0 để xử lý kết quả.
Phương pháp bề mặt đáp ứng là phương pháp hữu hiệu trong việc tối ưu
30
các quá trình chế biến thực phẩm. Đây là tập hợp các mô hình toán học và thống kê, liên quan giữa việc xử lý số liệu và thành lập phương trình hồi quy để mô tả các thông số đầu vào tới tính chất của sản phẩm [48],
Ke hoạch hỗn hợp bậc hai tâm xoay được sử dụng khi xác định các hệ số của phương trình hồi quy. Để kế hoạch hỗn hợp là tâm xoay, giá trị cánh tay đòn a chọn từ điều kiện:
a = 2k/4
Số điểm ở tâm theo kế hoạch no được tăng lên 5 để ma trận không suy biến, do vậy nên kế hoạch này sẽ tránh được sai số khi xác định hàm mục tiêu Y ở các điểm thí nghiệm của bề mặt biểu diễn. Mô hình thí nghiệm được thực hiện theo mô hình toán của phần mềm Modde 5.0
Trong nghiên cứu này, tôi tiến hành theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm với 2 yếu tố khảo sát như bảng 3.1.
Trong đó, các giá trị 0; -1 và +1 lần lượt là các giá trị ở tâm và biên của các biến được xét trong thí nghiệm của quy hoạch thực nghiệm. Giá trị - a và +a được xác định dựa vào quy tắc đòn bẩy; X1, x2 là các biến số cần tối ưu.
Trong quá trình thực hiện cần chú ý R2 và Q2, chúng sẽ cho biết mức độ tin cậy của mô hình thí nghiệm. R2 là độ biến thiên thật, Q2 là độ biến thiên ảo.
Trong đó, R2>0,8 và Q2<0,5 và độ sai lệch của chúng là [0,2; 0,3] cho thấy giá trị hồi quy là có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy.
Bảng 3.3: Quy hoạch cấu trúc có tâm xoay cấp hai, hai yếu tố ảnh hưởng
STT Biến mã hóa
Xi x2
1 -1 -1
2 1 -1
3 -1 1
31
4 1 1
5 -a 0
6 a 0
7 0 -a
8 0 a
9 0 0
10 0 0
11 0 0
12 0 0
13 0 0
Theo phương pháp trực giao cấp hai, hai yếu tố ảnh hưởng thì phương trình hồi quy được biểu diễn như sau:
cs (%) = ao + aiXi + a2x2 + ai2xix2 + ai2xi2+ a22x22
Các kết quả của phương trình hồi quy được tìm ra từ việc giải phương trình ttong Modde 5.0 chỉ là các biến mã hóa (nhận khi giá trị p<0,05), do đó cần chuyển sang biến số thực như sau:
Zj — xOj
Xj = ; i = 1; 2; 3; ... k
1 AXj
x_max _ x_min X_max _|_ x_min
Trong đó: AXj = J—; xOj = J—Ị j
Zj: giá trị thật của yếu tố gọi là biến thực Xj: giá trị mã hóa của yếu tố gọi là biến mã hóa
XQ: giá tri mức cơ sở
Các thí nghiệm được thực hiện với các yếu tố như bảng 3.2
32
Bảng 3.4: Giá trị tâm và các bước nhảy trong thí nghiệm tối ưu quá trình xử lý nhiệt nguyên liệu.
Hàm mục tiêu: Hàm lượng GAGs (%) đạt cao nhất.
Qua đố xây dựng được phương trình hồi quy thể hiện quy luật tương tác giữa các yếu tố tới hàm mục tiêu khảo sát. Từ đố xác định được các thông số tối ưu.
■ Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thời gian quá trình nghiền sụn ức gà đến hàm lượng GAGs.
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất, từ đó chọn được thời gian của quá trình nghiền sụn để tiến hành các thí nghiệm sau.
Bảng 3.5: Điều kiện thí nghiệm 4
33
■ Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ sụn:đệm đến hàm lưựng GAGs.
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất, từ đó chọn được tỷ lệ sụn:đệm để tiến hành các thí nghiệm sau.
Bẵng 3.6: Điều kiện thí nghiệm 5
34
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất, từ đó chọn được pH trong quá tnnh thủy phân để tiến hành các thí nghiệm sau.
Bâng 3.7: Điều kiện thí nghiệm 6
e
■ Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng E/S trong quá trình thủy phân đến hàm lượng GAGs.
35
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất, từ đó chọn được hàm lượng E/S Ưong quá trình thủy phân để tiến hành các thí nghiệm sau.
Bẵng 3.8: Điều kiện thí nghỉệm 7
■ Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình thủy phân đến hàm lượng GAGs.
Hàm mục tiêu càn đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất, từ đó chọn được nhiệt độ ừong quá trình thủy phân để tiến hành các thí nghiệm sau.
36
Bảng 3.9: Điều kiện thí nghiệm 8
é
" Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trong quá trình thủy phân đến hàm lượng GAGs.
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất, từ đó chọn được thời gian ttong quá trình thủy phân để tiến hành các thí nghiệm sau.
Bảng 3.10: Điều kiện thí nghiệm 9
37
" Thí nghiệm 10: Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình thủy phân sụn ức gà.
Tương tự như thí nghiêm 3, để xác định được các kết quả tối ưu từ các thí nghiệm tương tác của các yếu tố đến hàm mục tiêu, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) [48] và phần mềm Modde 5.0 để xử lý kết quả.
Ke hoạch hỗn hợp bậc hai tâm xoay được sử dụng khi xác định các hệ số của phương trình hồi quy. Để kế hoạch hỗn hợp là tâm xoay, giá tộ cánh tay đòn a chọn từ điều kiện:
ô = 2^
Số điểm ở tâm theo kế hoạch no được tăng lên 7 để ma ttận không suy biến, do vậy nên kế hoạch này sẽ tránh được sai số khi xác định hàm mục tiêu Y ở các điểm thí nghiệm của bề mặt biểu diễn.
38
Thí nghiệm này được tiến hành theo phương pháp quỵ hoạch thực nghiêm với 4 yếu tố khảo sát như bảng 3.3.
Trong đỏ, các giá trị 0; -1 và +1 làn lượt là các giá trị ở tâm và biên của cấc biến được xét trong thí nghiệm của quy hoạch thực nghiệm. Giá trị - a và +a được xác định dựa vào quy tắc đòn bẩy; Xi, x2, x3, X4 là các biến số cần tối ưu.
Trong quá trình thực hiện cần chú ý R2 và Q2, chứng sẽ cho biết mức độ tin cậy của mô hình thí nghiệm. R2 là độ biến thiên thật, Q2 là độ biến thiên ảo.
Trong đó, R2>0,8 và Q2<0,5 và độ sai lệch của chúng là [0,2; 0,3] cho thấy giá trị hồi quy là cố ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy.
Bảng 3.11: Quy hoạch cấu trúc có tâm xoay cấp hai, bốn yếu tố ảnh hưởng.
STT X1 x2 x3 X4
1 -1 -1 -1 -1
2 1 -1 -1 -1
3 -1 1 -1 -1
4 1 1 -1 -1
5 -1 -1 1 -1
6 1 -1 1 -1
7 -1 1 1 -1
8 1 1 1 -1
9 -1 -1 -1 1
10 1 -1 -1 1
11 -1 1 -1 1
12 1 1 -1 1
13 -1 -1 1 1
14 1 -1 1 1
15 -1 1 1 1
16 1 1 1 1
17 -a 0 0 0
18 +a 0 0 0
19 0 -a 0 0
39
20 0 +a 0 0
21 0 0 -a 0
22 0 0 +a 0
23 0 0 0 -a
24 0 0 0 +a
25 0 0 0 0
26 0 0 0 0
27 0 0 0 0
28 0 0 0 0
29 0 0 0 0
30 0 0 0 0
31 0 0 0 0
Theo phương pháp trực giao cấp hai, bốn yếu tố ảnh hưởng thì phương trình hồi quy được biểu diễn như sau:
cs (%) = ao + aiXi + a2x2 + a3X3 + a4X4 + ai2xix2 + ai3xix3 + ai4XiX4 + a23x2x3 + a^x2X4 + a34X3X4 + ai2 X12 + a22 x22 + a32 x32 + aị2 X42
Các kết quả của phương trình hồi quy được tìm ra từ việc giải phương trình trong Modde 5.0 chỉ là các biến mã hóa (nhận khi giá trị p<0,05), do đó cần chuyển sang biến số thực như sau:
Zj — x0j
Xj = ; i = 1; 2; 3;... k
1 AXj
v.max _ v.min v.max I „.min
Trong đó: AXj = j j ; xOj = j ★ j
Zj: giá trị thật của yếu tố gọi là biến thực Xj: giá trị mã hóa của yếu tố gọi là biến mã hóa xo: giá trị mức cơ sở
40
Các thí nghiệm được thực hiện với các yếu tố như bảng 3.4; các yếu tố cố định khác: Nhiệt độ và thời gian quá trình xử lý nhiệt sụn (Thí nghiêm 3), thời gian nghiền sụn (Thí nghiêm 4), tỷ lệ sụmđệrn (Thí nghiêm 5).
Bảng 3.12: Giá trị tâm và các bước nhảy trong thí nghiệm tối ưu quá trình thủy phân
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất; xây dựng được phương trình hồi quy thể hiện quy luật tương tác giữa các yếu tố tới hàm mục tiêu khảo sát từ đó tìm được các điều kiện tối ưu trong quá trình thủy phân để tiến hành các thí nghiêm sau.
" Thí nghiệm 11: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng TCA (%) trong quá trình kết tủa protein đến hàm lượng GAGs.
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất đồng thời hàm lượng protein ttong mẫu là thấp nhất, từ đó chọn được hàm lượng TCA (%) ttong quá trình kết tủa protein để tiến hành các thí nghiệm sau.
Bảng 3.13: Điều kiện thí nghiệm 11
STT Yếu tố Giá trị tâm Bước nhảy
1 pH(Zx) Thí nghiêm ố 0,5
2 Hàm lượng E/S (Z2, % w/wpro) Thí nghiêm 7 0,2
3 Nhiệt độ (Z3, °C) Thí nghiêm 8 5
4 Thời gian (Z4, phút) Thí nghiêm 9 120
41
tíchỉethanol trong quá trình kết tủa GAGs đến hàm lượng GAGs.
Hàm mục tiêu cần đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất đồng, từ đó chọn được tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol trong quá trình kết tủa GAGs để tiến hành các thí nghiệm sau.
Bảng 3.14: Điều kiện thí nghiệm 12
42
■ Thí nghiệm 13: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quần sụn ức gà đến hàm lượng GAGs.
Hàm mục tiêu càn đạt được: Hàm lượng GAGs (%) cao nhất đồng, từ đỏ biết được thời gian bảo quản nguyên liệu phù hợp trong quá trình làm nghiên cứu.
Bảng 3.15: Điều kiện thí nghiệm 13
43
3.3.4 Phương pháp phân tích
- Xác định hàm lượng GAGs bằng phương pháp của Famdale và các cộng sự (Phụ lục A.8)
- Xác định hàm lượng nitơ tổng (Phụ lục A.4)
- Xác định hàm lượng lipỉd bằng phương pháp Soxhlet (Phụ lục A.3) - Xác định hàm lượng protein hòa tan (Phụ lục A.5)
- Xác định ẩm (Phụ lục A. 1)
- Xác định hàm lượng tro (Phụ lục A.2)
- Xác định hoạt tính của papain bằng phương pháp Anson cải tiến (Phụ lục A.7)
- Xác định chỉ số DH (Phụ lục A.6)
- Xác định hàm lượng GAGs bằng phương pháp HPLC (Phụ lục A. 11) 3.3.5 Phương pháp xử lý sỗ liệu
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ít nhất 3 lần.
Tất cả dữ liệu được phân tích phương sai (ANOVA) nhằm kiểm định độ tin cậy với mức ý nghĩa 5% để đánh giá sự khấc biệt, sử dụng phần mềm STATGRAPHICS XV.I.
Quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 tâm xoay và tối ưu hóa các yếu tố nhiệt độ và thời gian quá trình xử lý nhiệt nguyên liệu (Thí nghiệm 3); tối ưu hóa các yếu tố pH, hàm lượng E/S, nhiệt độ và thời gian quá trình thủy phân (Thí nghiệm 10) bằng phần mềm Modde 5.0,