Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.7 Khảo sát ảnh hưởng của Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol trong quá trình kết tủa GAGs đến hàm lượng GAGs
70
trình kết tủa GAGs đến hàm lượng GAGs.
■ Điều kiện cố định:
- Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 8Ố°C - Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút - Thời gian nghiền sụn: 40 giây - Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10
- pH: 7,1
- Hàm lượng E/S: 0,62% (w/wpro) - Nhiệt độ: 65°c
- Thời gian thủy phân: 230 phút
Hình 4.14: Ảnh hưởng của Tỷ lệ dịch sau thẩm tíchỉethanol trong quá trình kết tủa GAGs đến HGAGs.
Nhận xét:
Từ kết quả hình 4.14 ta có, ở Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol là 1:0,5;
1:1 và 1:2 thì HGAGS lãng lên lần lượt là 6,31 ± 4,68%; 9,66 ± 1,90% và 11,02 ± 4,77%. Ở tỷ lệ 1:3 và 1:4, HGAGS đạt cực đại với HGAGS lần lượt là 12,17 ± 1,51%
và 12,07 ± 3,1%; sự khác nhau về HGAGS Ở hai tỷ lệ này không cỗ ý nghĩa thống kê, p>0,05 (Phụ lục C.8).
71
Giải thích:
Ethanol ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrate của GAGs và làm GAGs kết tủa. Tuy nhiên tùy thuộc vào nồng độ ethanol mà ta có thể thu được hàm lượng GAGs cao nhất. Ở tỷ lệ 1:0,5 và 1:1, ethanol không đủ để tủa được hết GAGs, do đó HGAGS thấp. Ở tỷ lệ cao 1:2, 1:3 và 1:4, HGAGS tăng cao và đạt được giá trị cực đại.
Kết quả nghiên cứu trên cũng cỏ sự tương đồng với nghiên cứu của J.
Xỉe và cộng sự (2014), khỉ chọn Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol là 1:3 để nghiên cứu [40].
/srá luận:
Để thu được HGAGS cao nhất và tiết kiệm ethanol, tôi chọn Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol là 1:3 (tương đương với ethanol 72%) để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
4.8 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quân sụn ức gà đến hàm lượng GAGs.
■ Điều kiện cố định:
- Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86°c - Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút - Thời gian nghiền sụn: 40 giây - Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10
- pH: 7,1
- Hàm lượng E/S: 0,62% (w/Wpro) - Nhiệt độ: 65°c
- Thời gian thủy phân: 230 phút
72
Hình 4.15: Ảnh hưởng của thời gian bảo quản sụn đến HGAGs
Nhện xét:
Từ kết quả hình 4.15 ta có, HGAGS trong tuần 1 và 2 lần lượt là 14,03 + 1,95% và 13,97 ± 2,56%, các giá trị này khác biệt không có ý nghĩa so với HGAGS
của nguyên liệu ban đầu (14,21 ± 2,62%), p<0,05 (Phụ lục C.9). Sau khi bảo quản 3 tuần, HGAGS giảm xuống còn 12,96 ± 2,12%, và tiếp tục giảm xuống thấp ở tuần 4 và sau 12 tuần lần lượt là 8,90 + 5,06% và 5,44 + 5,03%.
Giải thích:
Trong thời gian đầu bảo quản, nguyên liệu chưa có nhiều thay đổi. Nhưng khỉ kéo dài thời gian cấp đông nguyên liệu, sụn bị mất nước, cấu trúc không còn như ban đầu, dẫn đến việc hiệu quả trích ly GAGs giảm, và HGAGS giảm.
Kết luận:
Từ kết quả khảo sát trên cho thấy thời gian bảo quản nguyên liệu ở nhiệt độ -18°c trong vòng 2 tuần là tốt nhất.
4.9 Phân tích chế phẩm GAGs thu đưực trong quá trình nghiên cửu 4.9.1 Phân tích thành phần hóa học của chế phẩm GAGs.
Mầu GAGs sau khỉ được sấy khô được đem phân tích các chỉ tiêu như hàm ẩm, hàm lượng protein, lipid, carbohydrate, fro. Ta cố kết quả thề hiện ở
73
bảng 4.12 (Phụ lục B.15B, và B.15B)
Bảng 4.8: Thành phần hóa học của chế phẩm GAGs
74
Theo kết quả nghiên cứu của H. M. Khan và cộng sự (2013), trong sản phẩm GAGs của ông cố hàm lượng của các thành phần hốa học là: ẩm 9,88%, protein 12,82%, lipid 0,69%, tro 11,12%, carbohydrate 65,49% [53],
Từ kết quả bảng 4.12, ta có thể thấy hàm ẩm của chế phẩm là 12,2%, cao hơn khoảng 1,2 lần so với hàm ẩm trong nghiên cứu của H. M. Khan và cộng sự (2013). Hàm lượng protein và tro có trong chế phẩm GAGs lần lượt là 8,42% và 10,03%, chiếm thấp hơn khoảng 1,5 lần và 1,1 lần so với nghiên cứu của H. M.
Khan và cộng sự. Trong chế phẩm GAGs chứa khoảng 69,35% carbohydrate, cao hơn kết quả nghiên cứu của Khan và cộng sự khoảng 1,1 lần. Hàm lượng lipid, không được tìm thấy trong chế phẩm.
4.9.2 Phân tích hàm luợng cs chế phẩm GAGs bằng phương pháp HPLC
CHknMATOli kAPHY:
§1 1
-4'^ --- í. I (ri
1
ử ĩ I ỉ 4 ỉ & 7 4 4 ít
Hình 4.16: sắc ký đồ của chất chuẩn Chondroitin sutfate - HPLC.
75
Hình 4.17: sắc ký đồ của chế phẩm GAGs - HPLC.
Nhận xét:
Từ hình 4.16 và 4.17 ta thấy, vị trí peak của mẫu chế phẩm GAGs trùng với peak của chất chuẩn chondroitin sulfate. Ở sắc ký đồ của chất chuẩn, chiều cao của peak là 2.982.215 với thời gian lưu là 3,233 phút; đối với mẫu chế phẩm GAGs có chiều cao peak là 3.144.168 với thời gian lưu là 3,227 phút. Từ đó ta có thể thấy rằng, ưong chế phẩm GAGs có chứa cs (Phụ lục B. 16, B. 17).
Chất chuẩn được tiêm vào máy có độ tinh khiết là 85%. Diện tích peak của chất chuẩn là 37.866.365 và diện tích peak của mẫu chế phẩm GAGs là 43.170.110. Theo công thức tính như phụ lục A.ll ta có, hàm lượng cs (%) có có chế phẩm GAGs như sau:
43170110.80.0,85.250
37866365.196,5. (1 - 0,122) . 200 ■100 = 56,17
Từ kết quả ửên cho thấy mẫu chế phẩm GAGs thu được chứa 56,17% cs và 43,83% còn lại là các thành phần khác, trong đó có thể chứa các GAG khác.
Hàm lượng cs có trong sụn ức gà được tính theo công thức:
cs (%) =
CHROMATOGRAPHY
76
cs (%) = --- --- = 8,11 (%) Trong đó: 56,17: Lượng cs chiếm trong chế phẩm GAGS
14,43: Hàm lượng GAGs có trong sụn (tính theo sụn khô), từ kết quả đo quang với thuốc thử DMB.
Hàm lượng cs có trong sụn ức gà đạt được 8,11% tính theo chất khô của sụn, do chế phẩm GAGs chưa trải qua quá trình tinh sạch nên hàm lượng cs còn thấp. Hàm lượng cs đạt được trong chế phẩm GAGs thấp hơn kết quả nghiên cứu của w. Gamjanagoonchom và cộng sự (2007), với hàm lượng cs trong sụn ức gà là 14,08% [19], Hàm lượng cs có trong một số nguyên liệu khác như: sụn cá tầm 26,51% [41], hải sâm giống p. graeffei 11,00% [54], vây cá mập 9,6%, xương ức cá sấu 11,55% [19], Các nguyên liệu này đều có giá thành cao và có nguồn cung cấp hạn hẹp, trong khi đó sụn ức gà là một nguyên liệu dồi dào và rẻ tiền. Vì vậy, sụn ức gà là một nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất GAGs nói chung và cs nói riêng.
4.9.3 Phân tích khối lượng phân tử của chế phẩm GAGs bằng phương pháp GPC.
Từ kết quả phụ lục B. 18 và B. 19, ta có khối lượng phân tử của mẫu chế phẩm GAGs là 256,9 kDa và khối lượng phân tử của mẫu cs thương mại là 203,4 kDa. Khối lượng phân tử của mẫu chế phẩm lớn hơn mẫu thương mại do chế phẩm có độ tinh sạch còn thấp, còn chứa protein và các thành phần khác.
Theo nghiên cứu của X. M. Lou và cộng sự (2002), GAGs từ sụn ức gà với độ tinh sạch của mẫu là 75,5% có khối lượng phân tử tương ứng là
48,5 kDa [20], cs ửong tự nhiên thường có khối lượng phân tử từ 50 - 200 kDa [55], Tùy thuộc vào từng loại nguyên liệu khác nhau thì cs mà khối lượng phân tử khác nhau [56],