1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký là kỹ thuật được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học, gồm các phương pháp dùng để phân tách các thành phần của một hỗn hợp dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử chất phân tích trên hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau:
pha tĩnh và pha động [1].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh.
Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa
giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa ra các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [1]. Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định.
Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký (sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion…).
Thực hiện quá trình sắc ký là đặt chất phân tích lên pha tĩnh ở đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký là các tương tác:
giữa các chất phân tích với pha tĩnh; giữa các chất phân tích với pha động và giữa pha tĩnh với pha động.
Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha động có thể là một chất lỏng (có thể ở trạng thái siêu tới hạn) hoặc chất khí được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn vào pha tĩnh. Pha tĩnh được cố định trong cột. Các chất tan sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa: chất tan – pha tĩnh – pha động. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau mà các thành phần của mẫu cần phân tích sẽ được tách ra riêng biệt.
1.3.2. Cấu tạo máy HPLC
Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật để tách định lượng bằng sắc ký lỏng. Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận được kết nối với nhau.
1.3.2.1. Hệ thống cấp pha động
Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh. Có 2 cách sử dụng pha động:
- Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký.
- Chương trình hóa dung môi: pha động là một hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2 – 4 dung môi được đựng trong các loại bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định. Có hai kiểu thực hiện chương trình dung môi:
+ Chương trình dung môi áp suất thấp: các dung môi đựng trong các bình riêng.
Mỗi bình có van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
+ Chương trình dung môi áp suất cao: điểm khác chủ yếu là mỗi dung môi có một bơm riêng, việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao. Chương trình này có tốn kém và cồng kềnh hơn với loại hòa trộn ở áp suất thấp. Tuy nhiên, nó có độ đúng và độ lặp lại cao hơn.
1.3.2.2. Hệ thống bơm
Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng những yêu cầu sau:
- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên (1 psi = 0,068 atm)
- Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 – 5,00 ml/phút
- Có thể chịu được sự tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn)
- Những máy sắc ký lỏng hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn. Khoảng bơm có lưu lượng dao động từ 2 – 3 ml/phút, áp suất có thể lên tới 10000 psi.
1.3.2.3. Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay bằng hệ thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vào vòng chứa mẫu (tiêm bằng tay) hay trong hệ tiêm mẫu tự động.
1.3.2.4. Cột sắc ký
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10 – 30 cm, đường kính trong 4 – 10 mm, thường có cột nhồi và cột bảo vệ. Cột nhồi thường cú hạt cỡ 5 – 10 àm, gần đõy cú loại cột nhỏ với đường kính trong 1 – 2 mm, dài 3 – 7,5 cm. Chất nhồi cột thường là silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ (hoặc liên kết hóa học với một chất hữu cơ). Ngoài sili- cagel người ta còn dùng một số loại hạt khác như nhôm oxyd, polymer xốp, chất trao đổi ion.
Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm tăng tuổi thọ của cột.
1.3.2.5. Detector và bộ phận ghi tín hiệu
Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín hiệu được ghi trên sắc ký đồ. Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:
- Đáp ứng nhanh và lặp lại
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ thấp.
- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng - Khoảng hoạt động tuyến tính rộng - Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng
Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính.
1.3.3. Ứng dụng HPLC
HPLC có 3 ứng dụng chính là định tính, định lượng và điều chế.
1.3.3.1. Định tính
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng điều kiện sắc ký (pha động, pha tĩnh, nhiệt độ) là những thông tin định tính giúp khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu. Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ thường gặp khó khăn. Do vậy, HPLC thường được sử dụng để phân tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ hay bằng các nguyên tắc phát hiện khác.
1.3.3.2. Phân tích định lượng
Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic.
Chiều cao pic thường dễ đo, tuy nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp, cân đối. Diện tích pic được sử dụng phổ biến hơn và đảm bảo cho kết quả tin cậy.
Những phương pháp thường dùng trong phân tích sắc ký:
- Phương pháp chuẩn ngoại: tiến hành chạy sắc ký ở cả hai mẫu chuẩn và thử trong cùng điều kiện. So sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử. Có 2 phương pháp:
+ Chuẩn hóa một điểm: chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử.
+ Chuẩn hóa nhiều điểm: xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định.
- Phương pháp thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của chất trong mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ ΔC và sự tăng của diện tích pic ΔS.
- Phương pháp chuẩn nội: người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch đối chiếu. Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn. Một số yêu cầu đối với chất chuẩn nội là: pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác;
pic của chất chuẩn nội phải gần với pic của chất phân tích.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: hàm lượng phần trăm của chất phân tích được xác định bằng tỷ số (tính theo %) của diện tích pic chất đó và diện tích các pic có trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và pic các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện).
CHƯƠNG 2