2.1. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Dung môi và hoá chất - Chất chuẩn:
+ Ketoconazol (Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP.HCM), lô QT050070317; hàm lượng 99,7%.
+ Climbazol (AK Scientific), lô 70801D; hàm lượng 99,8%.
- Methanol HPLC (Merck).
- Amoni acetat (Scharlau).
- Nước tinh khiết.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị được hiệu chuẩn đạt yêu cầu của phòng thí nghiệm theo ISO/IEC 1705:
- Máy sắc ký lỏng Shimadzu LC – 2030C 3D (Nhật) bao gồm:
+ Bơm
+ Detector DAD + Module điều khiển + Degasser
- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác tới 0,1 mg (Thuỵ Sĩ) - Máy lắc siêu âm
- Máy ly tâm (SIGMA)
- Dụng cụ thuỷ tinh: Bình định mức, cốc thuỷ tinh, đũa thuỷ tinh, ống đong, phễu lọc, pipet bầu…
- Xylanh 3,0 ml, màng lọc 0,45 àm.
- Vials trong suốt loại 1,5 ml 2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Ketoconazol và climbazol trong nền mẫu mỹ phẩm là các dầu gội đầu.
- Một số mẫu mỹ phẩm biết trước thành phần do Công ty Cổ phần Sao Thái Dương cung cấp được dùng làm nền để thẩm định phương pháp như ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các mẫu nền được sử dụng để xây dựng phương pháp phân tích
TT Tên mẫu Nơi sản xuất Thành phần Ký
hiệu
1 Dầu gội dược liệu Thái Dương 3 hương lá
Công ty Cổ phần
Sao Thái Dương Không chứa KCZ và CBZ
P1
2 Dầu gội dược liệu Thái Dương 3 hương hoa
Công ty Cổ phần
Sao Thái Dương P2
3 Dầu gội dược liệu Thái Dương 3 hương lá
Công ty Cổ phần Sao Thái Dương
Chứa CBZ, không chứa
KCZ
M1
4 Dầu gội dược liệu Thái Dương 3 hương hoa
Công ty Cổ phần
Sao Thái Dương M2
- Một số mẫu dầu gội đầu đang lưu hành trên thị trường để xác định sự có mặt của ketoconazol và climbazol như ở Hình 2.1.
Hình 2.1. Các mẫu dầu gội đầu lưu hành trên thị trường được sử dụng để kiểm tra phương pháp xây dựng
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xây dựng phương pháp phát hiện KCZ, CBZ có mặt trong chế phẩm với 2 quy trình:
+ Quy trình xử lý mẫu
+ Quy trình phân tích, phát hiện KCZ và CBZ bằng HPLC - Thẩm định phương pháp đã xây dựng về:
+ Độ thích hợp của hệ thống sắc ký + Độ đặc hiệu
+ Độ tuyến tính và khoảng xác định
+ Độ chính xác của phương pháp (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) + Độ đúng
+ Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện KCZ, CBZ trong một số chế phẩm dầu gội đầu đang lưu hành trên thị trường.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Xây dựng phương pháp phân tích với HPLC:
Sử dụng các mẫu đại diện cho nhóm sản phẩm dầu gội đầu để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích. Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký thích hợp, sau đó xử lý các kết quả thu được bằng thuật toán thống kê.
- Xây dựng quy trình xử lý mẫu:
Chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, chất phân tích bên trong môi trường pha mẫu (dựa vào 3 yếu tố: tính tan của chất phân tích, đặc điểm của nền mẫu và phương pháp phân tích).
- Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp:
Cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, bước sóng phân tích với detec- tor, thể tích tiêm mẫu. Định tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết của pic và chồng phổ UV – VIS, so sánh hệ số tương đồng phổ của pic nghi ngờ thu được từ mẫu thử với pic thu được từ mẫu chuẩn. Định lượng bằng cách so sánh diện tích pic thu được từ mẫu thử so với mẫu chuẩn.
Do đặc thù của các mẫu chế phẩm nghiên cứu có thành phần KCZ, CBZ ở mức hàm lượng rất nhỏ, đồng thời KCZ là thành phần cấm trong các sản phẩm mỹ phẩm và CBZ là thành phần được phép xuất hiện trong mỹ phẩm với vai trò chất bảo quản ở mức giới hạn hàm lượng 0,5% [14], chúng tôi chọn nồng độ giới hạn định lượng đối với KCZ và nồng độ giới hạn theo quy định đối với CBZ để đánh giá phương pháp,
bao gồm các nội dung: tính đặc hiệu, độ tuyến tính và khoảng xác định, độ đúng, độ lặp lại.
- Độ đặc hiệu:
Tiến hành sắc ký các loại mẫu: mẫu trắng; mẫu chuẩn hỗn hợp; mẫu nền (mẫu chế phẩm placebo không có chất cần phân tích) và mẫu thử (có chứa 1 thành phần CBZ) thêm chuẩn KCZ được chuẩn bị theo quy trình.
Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn: Pic của các chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic khác (nếu có trong nền mẫu); pic của chất cần phân tích có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn thu được từ mẫu chuẩn hỗn hợp. Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.
Pic của các chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết. Hệ số chồng phổ UV – VIS của các pic hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc ký đồ của dung dịch thử thêm chuẩn với các pic tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp phải đạt từ 99,0% trở lên.
- Độ tuyến tính và khoảng xác định:
Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (tối thiểu 5 dung dịch). Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu.
Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995). Nếu r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp.
- Độ đúng:
Xác định trên các mẫu tự tạo. Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn các chất cần phân tích vào các nền mẫu không có chất cần phân tích. Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ phân tích. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính. Tính lượng thu hồi theo công thức:
Tham khảo hướng dẫn của ICH, ASEAN và AOAC, yêu cầu với phép thử định lượng là tỷ lệ thu hồi 85,0% – 110,0%; RSD của tỷ lệ thu hồi của CBZ và KCZ lần lượt không quá 6,0% và 13,0% ở mỗi mức nồng độ.
Bảng 2.2. Giá trị độ chính xác và độ thu hồi yêu cầu theo AOAC
Đơn vị RSD (%) Độ thu hồi (%)
100% 1,3 98 – 102
10% 1,9 98 – 102
1% 2,7 97 – 103
0,1% 3,7 95 – 105
100 ppm 5,3 90 – 107
10 ppm 7,3 80 – 110
1 ppm 11 80 – 110
100 ppb 15 80 – 110
10 ppb 21 60 – 115
1 ppb 30 40 – 120
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):
Có thể tiến hành theo cách pha loãng hoặc dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng để xác định giới hạn phát hiện.
Giá trị của LOD được xác định bằng công thức:
LOD = (3,3 × δ)/a Trong đó:
δ là độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu nền (placebo),
a là hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính (y = ax + b) giữa nồng độ và đáp ứng pic của chất cần phân tích.
Giá trị của LOQ được xác định bằng công thức:
LOQ = 3,3 × LOD (kl/tt).
2.5. XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Các kết quả thực nghiệm được xử lý thống kê với các hàm thống kê thông dụng trên Microsoft Excel.
CHƯƠNG 3