KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
3.2.2. Thẩm định phương pháp
Tiêm riêng biệt dung dịch thử, dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký lỏng. Tiến hành sắc ký với các điều kiện ở trên trong khoảng 30 phút. Ghi lại sắc ký đồ.
Dựa vào thời gian lưu: thời gian lưu của pic thu được từ dung dịch thử phải phù hợp với thời gian lưu của pic thu được từ dung dịch chuẩn.
So sánh phổ UV – VIS của pic thu được từ dung dịch thử có thời gian lưu tương ứng với pic thu được từ dung dịch chuẩn và hệ số chồng phổ của các pic này phải đạt từ 0,99 trở lên.
Phương pháp xây dựng được thẩm định với các nội dung: độ thích hợp của hệ thống sắc ký, tính đặc hiệu, độ tuyến tính và khoảng xác định, độ chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
3.2.2.1. Độ thích hợp của hệ thống sắc ký
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chất chuẩn climbazol và ketoconazol lần lượt là 25 àg/ml và 0,2 àg/ml vào hệ thống sắc ký, kết quả thu được như ở Bảng 3.1.
Kết quả cho thấy hệ thống sắc ký có độ phân tách tốt, pic cân đối, độ lặp lại tốt với RSD của thời gian lưu nhỏ hơn 1,0% và của diện tích pic nhỏ hơn 2,0%; số đĩa lý thuyết trên 2000; hệ số kéo đuôi nhỏ hơn 2,0 và độ phân giải đạt trên 2,0, do vậy đáp ứng yêu cầu phân tích cho cả 2 hoạt chất climbazol và ketoconazol.
Bảng 3.1. Độ thích hợp của hệ thống sắc ký
STT Climbazol Ketoconazol
tR (phút) Spic (mAu.s) tR (phút) Spic (mAu.s)
1 11,80 105041 20,37 5775
2 11,83 104598 20,39 5824
3 11,88 103717 20,45 5626
4 11,93 106015 20,49 5669
5 11,97 103752 20,50 5763
6 11,85 105253 20,33 5642
Trung bình 11,88 104729,3 20,42 5716,5
RSD (%) 0,53 0,86 0,34 1,42
Số đĩa lý thuyết 11073 10644
Hệ số kéo đuôi 1,402 1,288
Hệ số phân giải 13,110
Như vậy, hệ thống sắc ký đạt yêu cầu về độ thích hợp hệ thống.
3.2.2.2. Độ đặc hiệu
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn với các mẫu sau:
- Mẫu trắng: Hỗn hợp dung môi methanol – dung dịch amoni acetat 0,5% (70:30).
- Dung dịch hỗn hợp chuẩn được chuẩn bị theo mục 3.1.2.2.
- Các mẫu thử placebo được xử lý theo mục 3.1.2.1. không chứa thành phần KCZ và CBZ (P1, P2).
- Các mẫu thử thêm chuẩn ketoconazol (M1K, M2K): Cân chính xác khoảng 0,5 g mẫu M1 (hoặc M2) vào bình định mức 100 ml, thêm chính xác 4,0 ml dung dịch chuẩn gốc Ko vào mỗi bình, thêm vào mỗi bình 50 ml pha động, lắc siêu âm 30 phút để hoà tan, để về nhiệt độ phòng, thêm pha động vừa đủ tới vạch, lắc đều. Để lạnh trong nước đá 30 phút, ly tâm 9000 vòng/phút trong 10 phút. Để về nhiệt độ phòng, lấy dịch lọc trong qua màng lọc 0,45 àm.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, kết quả thu được như ở hình 3.2. Kết quả cho thấy:
- Trên sắc ký đồ mẫu placebo không xuất hiện pic ở thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của bất kỳ chất nào trong số các chất nghiên cứu KCZ, CBZ.
a) b)
c) d)
e) f)
Hình 3.2. Sắc ký đồ độ đặc hiệu với KCZ, CBZ trên nền dầu gội đầu a) Mẫu trắng c) Mẫu placebo 1 (P1) e) Mẫu thêm chuẩn (M1K) b) Mẫu hỗn hợp chuẩn d) Mẫu placebo 2 (P2) f) Mẫu thêm chuẩn (M2K)
- Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử thêm chuẩn cho 2 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 2 pic chính thu được từ sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp. Khi so sánh phổ UV – VIS của các pic tương ứng cho độ đồng phổ cao: Hệ số similarity của CBZ và KCZ lần lượt là 0,9993 và 0,9949, đều lớn hơn 0,99. Thứ tự rửa giải và thời gian lưu của các chất phân tích trong các mẫu khác nhau được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thời gian lưu và hệ số phân giải của các chất nghiên cứu trên các mẫu khác nhau
Mẫu thử Thời gian lưu (phút)
Hệ số phân giải Rs Climbazol Ketoconazol
Mẫu thử thêm chuẩn
ketoconazol (M1K) 12,29 20,91 14,05
Mẫu thử thêm chuẩn
ketoconazol (M2K) 12,51 21,40 3,96
3.2.2.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định
Từ các dung dịch chuẩn gốc climbazol (Co) và ketoconazol (Ko) được xử lý theo mục 3.1.2.2, pha loãng thành các dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ tương ứng được thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp Dung
dịch
Chuẩn Co
(ml)
Chuẩn Ko
(ml)
Thể tích bình định mức (ml)
Nồng độ (àg/ml) Climbazol Ketoconazol
S1 1,0 5,0 250 1,18 0,11
S2 1,0 4,0 100 2,95 0,21
S3 1,0 3,0 50 5,91 0,32
S4 4,0 5,0 50 23,63 0,53
S5 5,0 10,0 50 29,54 1,07
S6 6,0 15,0 50 35,45 1,60
Với 29,6 mg lượng chất chuẩn climbazol được sử dụng để pha dung dịch chuẩn gốc (theo mô tả ở mục 3.1.2.2.). Từ dung dịch chuẩn gốc (Co) tiến hành pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 5 – 120% so với nồng độ dự kiến định lượng.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, kết quả thu được như ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của CBZ và KCZ
Dung dịch
Climbazol Ketoconazol
Nồng độ (àg/ml)
Diện tích pic (mAu.s)
Nồng độ (àg/ml)
Diện tích pic (mAu.s)
S1 1,18 4936 0,11 3747
S2 2,95 11448 0,21 5471
S3 5,91 22990 0,32 8945
S4 23,63 94829 0,53 15009
S5 29,54 122028 1,07 32068
S6 35,45 144647 1,60 47191
Đường chuẩn xác định được như ở Hình 3.3. Trong khoảng nồng độ 1,18 – 35,45 àg/ml của climbazol cú sự tương quan chặt chẽ giữa diện tớch pic và nồng độ
climbazol trong mẫu với hệ số tương quan (r) thu được là 0,9998. Đường chuẩn có hệ số góc là 4104 và hệ số chắn (intercept) là -667,6.
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ climbazol.
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ketoconazol.
Với 26,8 mg lượng chất chuẩn ketoconazol được sử dụng để pha dung dịch chuẩn gốc (theo mô tả ở mục 3.1.2.2.). Từ dung dịch chuẩn gốc (Ko) tiến hành pha các dung dịch chuẩn có nồng độ bằng 1/2 – 10 lần so với nồng độ dự kiến định lượng.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, kết quả thu được như ở Bảng 3.4.
Đường chuẩn xác định được như ở Hình 3.4. Trong khoảng nồng độ 0,11 – 1,60 àg/ml của ketoconazol cú sự tương quan chặt chẽ giữa diện tớch pic và nồng độ của ketoconazol trong mẫu với hệ số tương quan (r) thu được là 0,9995. Đường chuẩn có hệ số góc là 29785 và hệ số chắn (intercept) là - 323,7.
3.2.2.4. Đánh giá độ đúng
Thêm chính xác một lượng chất chuẩn CBZ và KCZ vào nền mẫu placebo sao cho sau khi xử lý theo quy trình, phân tích nồng độ dung dịch cuối cùng đem sắc ký phải nằm trong khoảng 80 – 120% so với nồng độ định lượng. Tiến hành ở 3 mức nồng độ khác nhau: 80%, 100% và 120%, mỗi nồng độ thực hiện 3 lần. Dựa vào diện tích pic của hoạt chất tương ứng trong dung dịch hỗn hợp chuẩn để tính ra lượng chất chuẩn tìm thấy.
Kết quả khảo sát độ đúng của CBZ và KCZ trên nền mẫu placebo dầu gội đầu Độ đúng được khảo sát trên các nền mẫu placebo không chứa 2 hợp chất cần nghiên cứu CBZ và KCZ là Dầu gội dược liệu Thái Dương 3 hương lá (P1) và Dầu gội dược liệu Thái Dương 3 hương hoa (P2). Kết quả thu được như ở Bảng 3.5 và 3.6.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với KCZ và CBZ trên nền mẫu placebo 1 (P1)
Mức đồng độ (%)
Lượng mẫu
(g)
Climbazol Ketoconazol
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
Lượng thêm
vào (mg)
Tỷ lệ thu hồi (%)
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
Lượng thêm
vào (mg)
Tỷ lệ thu hồi (%) 80 0,5122 84830 2,061 2,092 98,54 4308 0,0153 0,0152 100,48 80 0,5026 86680 2,106 2,092 100,69 4250 0,0151 0,0152 99,13 80 0,5039 86587 2,104 2,092 100,59 4260 0,0152 0,0152 99,36 100 0,5068 108461 2,636 2,615 100,80 5893 0,0210 0,0203 103,09 100 0,5044 107981 2,624 2,615 100,35 5814 0,0207 0,0203 101,70 100 0,5019 108044 2,625 2,615 100,41 5807 0,0207 0,0203 101,58 120 0,5079 131335 3,191 3,138 101,71 7419 0,0264 0,0254 103,82 120 0,5173 130650 3,175 3,138 101,18 7518 0,0267 0,0254 105,21 120 0,5011 131131 3,186 3,138 101,55 7544 0,0268 0,0254 105,58
Trung bình 100,65 102,22
RSD (%) 0,92 2,32
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với KCZ và CBZ trên nền mẫu placebo 2 (P2)
Mức đồng độ (%)
Lượng mẫu
(g)
Climbazol Ketoconazol
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
Lượng thêm
vào (mg)
Tỷ lệ thu hồi (%)
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
Lượng thêm
vào (mg)
Tỷ lệ thu hồi (%) 80 0,5025 84934 2,064 2,092 98,66 4381 0,0156 0,0152 102,18 80 0,5017 85444 2,076 2,092 99,26 4390 0,0156 0,0152 102,39 80 0,5035 86503 2,102 2,092 100,49 4376 0,0156 0,0152 102,07 100 0,5161 104012 2,527 2,615 96,66 5626 0,0200 0,0203 98,42 100 0,5144 103881 2,524 2,615 96,54 5814 0,0207 0,0203 101,70 100 0,5119 104177 2,531 2,615 96,81 5713 0,0203 0,0203 99,94 120 0,5169 129493 3,147 3,138 100,28 7137 0,0254 0,0254 99,88 120 0,5073 126719 3,079 3,138 98,14 7015 0,0250 0,0254 98,17 120 0,5009 128216 3,116 3,138 99,30 7120 0,0253 0,0254 99,64
Trung bình 98,46 100,49
RSD (%) 1,55 1,63
Kết quả cho thấy tỷ lệ thu hồi (%) của CBZ và KCZ đều nằm trong khoảng tiêu chuẩn là 85,0% - 110,0% ở mỗi mức nồng độ với:
- Tỷ lệ thu hồi (%) của climbazol trong mẫu P1 (n = 6) là 100,65 và P2 (n = 6) là 98,46, với RSD lần lượt là 0,92% và 1,55%.
- Tỷ lệ thu hồi (%) của ketoconazol trong mẫu P1 (n = 6) là 102,22 và P2 (n = 6) là 100,49, với RSD lần lượt là 2,32% và 1,63%.
Như vậy, phương pháp đưa ra đạt yêu cầu về độ đúng.
3.2.2.5. Độ lặp lại
Thêm chính xác một lượng chất chuẩn KCZ vào nền mẫu thử đã chứa thành phần CBZ (M1 hoặc M2) sao cho sau khi xử lý, nồng độ KCZ dung dịch cuối cùng đem sắc ký phải tương ứng với nồng độ định lượng. Tiến hành khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên hai nền mẫu thử thêm chuẩn M1K và M2K, mỗi mẫu thử được thực hiện 6 lần. Dựa vào diện tích pic của hoạt chất tương ứng trong dung dịch hỗn hợp chuẩn để tính ra lượng chất chuẩn tìm thấy. Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.7 và Bảng 3.8.
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với KCZ và CBZ trên nền mẫu thử M1 thêm chuẩn KCZ (M1K)
TT
Lượng mẫu
(g)
Climbazol Ketoconazol
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
% so với nhãn
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
Lượng thêm
vào (mg)
Tỷ lệ thu hồi
(%) 1 0,4965 89182 2,167 87,30 5767 0,0205 0,0203 100,88 2 0,4903 88025 2,139 87,25 5738 0,0204 0,0203 100,38 3 0,6007 107660 2,616 87,10 5673 0,0202 0,0203 99,43 4 0,5314 94202 2,289 86,15 5758 0,0205 0,0203 100,92 5 0,5531 99731 2,423 87,63 5680 0,0202 0,0203 99,36 6 0,5757 104356 2,536 88,10 5730 0,0204 0,0203 100,43
Trung bình (n = 6) 87,26 100,23
RSD (%, n = 6) 0,74 0,68
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với KCZ và CBZ trên nền mẫu thử M2 thêm chuẩn KCZ (M2K)
TT
Lượng mẫu
(g)
Climbazol Ketoconazol
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
% so với nhãn
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
Lượng thêm
vào (mg)
Tỷ lệ thu hồi
(%) 1 0,5067 91273 2,218 87,54 5651 0,0201 0,0203 99,04 2 0,4984 91762 2,230 89,48 5655 0,0201 0,0203 98,92 3 0,5183 92049 2,237 86,31 5647 0,0201 0,0203 98,78 4 0,5098 91978 2,235 87,68 5505 0,0196 0,0203 96,48 5 0,5415 98416 2,391 88,33 5688 0,0202 0,0203 99,50 6 0,5507 99113 2,408 87,47 5584 0,0199 0,0203 97,87
Trung bình (n = 6) 87,80 98,43
RSD (%, n = 6) 1,20 1,11
Kết quả khảo sát cho thấy RSD của độ lặp lại ở CBZ và KCZ lần lượt đạt yêu cầu với mức giá trị dưới 6,0% và 13,0% với:
- Tỷ lệ hàm lượng climbazol so với nhãn ở mẫu M1K (n = 6) là 87,26% và mẫu M2K là 87,80%, với RSD lần lượt là 0,74% và 1,20%.
- Tỷ lệ thu hồi ketoconazol ở mẫu M1K (n = 6) là 100,23% và mẫu M2K là 98,43%, với RSD lần lượt là 0,68% và 1,11%.
Như vậy, phương pháp đưa ra đạt tiêu chuẩn về độ lặp lại.
3.2.2.6. Độ chính xác trung gian
Tiến hành tương tự như đánh giá độ lặp lại nhưng khác ngày hoặc khác người thực hiện. Kết quả phân tích các mẫu M1K và M2K thu được như ở các Bảng 3.9 và Bảng 3.10.
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với KCZ và CBZ trên nền mẫu thử M1 thêm chuẩn KCZ (M1K)
TT
Lượng mẫu
(g)
Climbazol Ketoconazol
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
% so với nhãn
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
Lượng thêm
vào (mg)
Tỷ lệ thu hồi
(%) 1 0,5022 92739 2,174 86,57 5936 0,0198 0,0199 99,59 2 0,5121 95567 2,240 87,49 5941 0,0199 0,0199 99,67 3 0,4857 90488 2,121 87,34 5958 0,0199 0,0199 99,96 4 0,4991 93315 2,187 87,65 5860 0,0196 0,0199 98,31 5 0,5239 97927 2,295 87,63 5804 0,0194 0,0199 97,37 6 0,5136 96564 2,263 88,14 5963 0,0199 0,0199 100,04
Trung bình (n = 6) 87,47 99,16
RSD (%, n = 6) 0,59 1,08
Trung bình (n = 12) 87,36 99,70
RSD (%, n = 12) 0,65 1,03
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với KCZ và CBZ trên nền mẫu thử M2 thêm chuẩn KCZ (M2K)
TT
Lượng mẫu
(g)
Climbazol Ketoconazol
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
% so với nhãn
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng tìm thấy (mg)
Lượng thêm
vào (mg)
Tỷ lệ thu hồi
(%) 1 0,5477 102461 2,402 87,70 5836 0,0195 0,0199 97,91 2 0,5385 101012 2,368 87,94 5874 0,0196 0,0199 98,55 3 0,5589 105491 2,473 88,48 5975 0,0200 0,0199 100,24 4 0,4991 91894 2,154 86,31 5890 0,0197 0,0199 98,82 5 0,4915 91838 2,153 87,60 5836 0,0195 0,0199 97,91 6 0,5307 100605 2,358 88,87 5799 0,0194 0,0199 97,29
Trung bình (n = 6) 87,82 98,45
RSD (%, n = 6) 1,00 1,04
Trung bình (n = 12) 87,81 98,44
RSD (%, n = 12) 1,05 1,03
Kết quả khảo sát cho thấy RSD của độ chính xác trung gian ở CBZ và KCZ lần lượt đạt yêu cầu với mức giá trị dưới 6,0% và 13,0% với:
- Tỷ lệ hàm lượng climbazol so với nhãn ở mẫu M1K (n = 12) là 87,36% và mẫu M2K là 87,81%, với RSD lần lượt là 0,65% và 1,05%.
- Tỷ lệ thu hồi ketoconazol ở mẫu M1K (n = 12) là 99,70% và mẫu M2K là 98,44%, với RSD trên 2 mẫu đều là 1,03%.
Như vậy, phương pháp đưa ra đạt tiêu chuẩn về độ chính xác trung gian.