CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. Khảo sát quá trình trích ly saponin triterpenoid bằng nước
Khảo sát này đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:nước (w/v tính trên nguyên liệu tươi với độ ẩm đã khảo sát ở 3.1) đến quá trình trích ly thu nhận saponin triterpenoid từ đảng sâm. Chúng tôi chọn tỉ lệ nguyên liệu và nước sao cho lượng nước sử dụng phù hợp đạt được hiệu quả trích ly cao.
Mỗi mốc thí nghiệm được tiến hành khảo sát lặp lại 3 lần và kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Số liệu được xử lý ANOVA để nhận xét sự khác biệt giữa các mẫu.
Chúng tôi tiến hành xử lý ANOVA kết quả khảo sát và nhận thấy rằng P-value
< 0,05 đều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các kết quả khảo sát ở mức ý nghĩa 95% và được thể hiện ở Bảng PL1.1 (xem Phụ lục)
Từ Bảng PL1.1 và Hình 3.1 ta nhận thấy rằng khi tăng tỉ lệ nước so với nguyên liệu thì hàm lượng saponin triterpenoid cũng tăng nhanh chóng từ tỉ lệ 1:5 đến 1:7 cụ thể tăng từ 1304,64mg/100gDW đến 1818,33 mg/100gDW. Tuy nhiên khi tiếp tục
51
tăng tỉ lệ từ 1:7 đến 1:9 thì hàm lượng saponin triterpenoid có sự chuyển biến chậm và theo xu hướng giảm nhưng mức độ giảm không đáng kể lắm. Từ kết quả phân tích ANOVA ta thấy rằng hàm lượng saponin triterpenoid thu được ở tỉ lệ 1:7 có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 95% so với các tỉ lệ 1:5 và 1:6, và không có khác biệt nhiều với tỉ lệ 1:8, hàm lượng saponin triterpenoid thu được từ tỉ lệ 1:7 đến 1:9 trong khảo sát bắt đầu có xu hướng không tăng nữa, trong đó tỉ lệ 1:7 cho thấy hàm lượng saponin triterpenoid thu được là cao nhất.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:nước trích ly đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được
Sự vận chuyển chất tan từ bên trong tế bào thực vật ra bên ngoài dung môi trải qua con đường khuếch tán là chủ yếu. Động lực của quá trình trích ly là sự chênh lệch nồng độ của cấu tử trích ly ở trong nguyên liệu và ở trong dung môi. Các phân tử chất tan sẽ dịch chuyển từ tâm của nguyên liệu đến vùng bề mặt nguyên liệu vào dung môi. Các phần tử dung môi sẽ khuếch tán từ vùng bên ngoài nguyên liệu vào trong cấu trúc mao dẫn của nguyên liệu. Sự khuếch tán này sẽ giúp cho quá trình chiết rút các cấu tử cần trích ly từ nguyên liệu vào dung môi xảy ra nhanh và triệt để hơn [32].
Khi lượng dung môi tăng thì sự chênh lệch gradiant nồng độ càng lớn dẫn đến động
1304,64a 1340,56a
1818,33b 1790,56b 1786,85b
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
1:5 1:6 1:7 1:8 1:9
Hàm lượng Triterpenoid saponin (mg/100gDW)
Tỉ lệ nguyên liệu:nước (w/v)
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau là khác nhau có ý nghĩa thống kê P < 0,05
52
lực trích ly càng cao và ngược lại. Ngoài ra, khi lượng dung môi sử dụng tăng sẽ tạo cơ hội cho các thành phần trong nguyên liệu tiếp xúc với dung môi trích ly tốt hơn, làm tốc độ thấm lọc của các chất tan sẽ cao hơn [33], điều này ta nhận thấy rõ ràng ở tỉ lệ 1:5 đến 1:7, khi tăng lượng nước để trích ly thì hàm lượng saponin triterpenoid tăng đáng kể. Tuy nhiên từ tỉ lệ 1:7 đến 1:9 ta nhận thấy hàm lượng saponin triterpenoid thu được không tăng nữa, điều này cho thấy đã có một sự cân bằng trong quá trình trích ly, động lực quá trình trích ly sẽ không tăng nữa khi quá trình trích ly đạt trạng thái cân bằng [34], sự chênh lệch nồng độ của các chất tan so với dung môi trích ly không nhiều, điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả khảo sát khi chúng tôi tiến hành tăng tỉ lệ dung môi từ 1:7 đến 1:9.
Từ những phân tích trên, chúng tôi chọn tỉ lệ nguyên liệu : nước là 1:7 (w/v) là kết quả phù hợp nhất khi trích ly saponin triterpenoid từ đảng sâm và tỉ lệ này được dùng làm thông số cố định cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ của nước ảnh hưởng đến quá trình thu nhận saponin triterpenoid bằng nước
Khảo sát này đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly thu nhận saponin triterpenoid từ đảng sâm. Chúng tôi chọn nhiệt độ trích ly sao cho phù hợp và đạt được hiệu quả trích ly cao.
Mỗi mốc thí nghiệm được tiến hành khảo sát lặp lại 3 lần và kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Số liệu được xử lý ANOVA để nhận xét sự khác biệt giữa các mẫu.
Chúng tôi tiến hành xử lý ANOVA kết quả khảo sát và nhận thấy rằng P-value
< 0,05 đều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các kết quả khảo sát ở mức ý nghĩa 95% và được thể hiện ở Bảng PL1.2 (xem Phụ lục)
Từ Bảng PL1.2 và Hình 3.2 ta nhận thấy có một xu hướng là khi nhiệt độ càng tăng thì hiệu quả trích ly thu nhận saponin triterpenoid càng tăng, cụ thể ở nhiệt độ trích ly là 500C thì hàm lượng saponin triterpenoid chỉ đạt 1116,48mg/100gDW, nhưng khi nhiệt độ tăng đến 700C thì hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được
53
là 2245,81mg/100gDW, cao gấp 2 lần, điều đó cho thấy rằng có một sự tác động đáng kể của nhiệt độ đến hiệu quả trích ly. Tuy nhiên điều này không được duy trì theo xu hướng tăng hàm lượng saponin triterpenoid khi chúng tôi tiến hành tăng nhiệt độ, khi tiếp tục tăng thêm 100C thì hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được không khác biệt so với ở nhiệt độ 700C, khi tăng đến 900C thì hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được không tăng mà lại có xu hướng giảm.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được
Khi nhiệt độ trích ly tăng, sự gia nhiệt sẽ cung cấp năng lượng cho các phần tử trong hệ trích ly chuyển động hỗn loạn với vận tốc cao, làm tăng độ hòa tan. Ngoài ra khi tăng nhiệt độ, độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi sẽ giảm, tạo điều kiện cho dung môi dễ hòa tan các chất, nâng cao tính thấm ướt và khả năng xâm nhập vào gian bào thực vật [35]. Giải thích trên phù hợp với kết quả khảo sát mà chúng tôi đã thực hiện, hàm lượng saponin triterpenoid có xu hướng tăng khi tăng nhiệt độ. Hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được ở 700C và 800C không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 95% khi tiến hành phân tích ANOVA, khi nhiệt độ tăng đến 900C thì
1116,48a
1808,22b
2245,81c 2204,78c
2045,44d
0 500 1000 1500 2000 2500
50 60 70 80 90
Hàm lượng Triterpenoid saponin (mg/100gDW)
Nhiệt độ trích ly (0C)
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau là khác nhau có ý nghĩa thống kê P < 0,05
54
hàm lượng saponin triterpenoid có giảm so với ở mức nhiệt độ 700C và 800C nhưng lượng giảm này không đáng kể. Như vậy với nhiệt độ trích ly ở 700C thì hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được là cao nhất, đây là nhiệt độ phù hợp để tiến hành trích ly.
Từ những phân tích nêu trên, chúng tôi chọn nhiệt độ 700C cho quá trình trích ly thu nhận saponin triterpenoid bằng nước, thông số này tiếp tục được cố định để thực hiện khảo sát tiếp theo.
3.2.3. Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thu nhận saponin triterpenoid bằng nước
Khảo sát này đánh giá ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly thu nhận saponin triterpenoid từ đảng sâm. Chúng tôi chọn thời gian trích ly sao cho phù hợp và đạt được hiệu quả trích ly cao.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được
Mỗi mốc thí nghiệm được tiến hành khảo sát lặp lại 3 lần và kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Số liệu được xử lý ANOVA để nhận xét sự khác biệt giữa các mẫu.
1364,63a
1642,4b
1920,19c
2285d 2257,22d
150 350 550 750 950 1150 1350 1550 1750 1950 2150 2350 2550
30 60 90 120 150
Hàm lượng Triterpenoid saponin (mg/100gDW)
Thời gian trích ly (phút)
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau là khác nhau có ý nghĩa thống kê P < 0,05
55
Chúng tôi tiến hành xử lý ANOVA kết quả khảo sát và nhận thấy rằng P-value
< 0, đều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các kết quả khảo sát ở mức ý nghĩa 95%
và được thể hiện ở Bảng PL1.3 (xem Phụ lục)
Khi tiến hành khảo sát ở các mốc thời gian khác nhau, chúng tôi nhận thấy rằng, khi kéo dài thời gian trích ly thì hàm lượng saponin triterpenoid thu được cũng tăng theo, khi thời gian tăng từ 30 phút đến 120 phút thì hàm lượng saponin triterpenoid tăng từ 1364,63mg/100gDW đến 2285mg/100gDW và khi chúng tôi tiếp tục tăng nhiệt độ thì hàm lượng saponin triterpenoid thu được không tăng mạnh nũa và có xu hướng cân bằng, điều đó cho thấy ở kết quả phân tích ANOVA, mẫu đảng sâm trích ly ở thời gian 120 phút thu được hàm lượng saponin triterpenoid không có khác biệt ở mức ý nghĩa 95% so với mẫu trích ly ở 150 phút.
Thời gian trích ly và lượng chất thu được có một mối liên hệ, được thể hiện bằng đồ thị là một đường cong có 3 vùng riêng biệt với các đặc điểm khác nhau. Vùng đầu tiên tương ứng với giai đoạn đầu của quá trình trích ly, quá trình trích ly xảy ra nhanh chóng, lúc này động lực của quá trình trích ly là lớn nhất do sự chênh lệch gradient nồng độ là cao nhất, lượng chất trích ly được sẽ tăng theo thời gian. Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn trung gian, động lực quá trình trích ly bắt đầu giảm, lượng chất trích ly được bắt đầu ở trạng thái cân bằng, chuyển tiếp sang giai đoạn cuối thì sự chênh lệch gradient nồng độ nhỏ, động lực quá trình trích ly giảm, lượng chất trích ly được gần đạt trạng thái cân bằng [36]
Như vậy, trong trường hợp này, giai đoạn đầu khi thời gian trích ly tăng thì lượng saponin triterpenoid thu được cũng tăng theo nhưng đến một lúc nào đó thì hàm lượng saponin triterpenoid thu được không tăng nữa mà đạt đến mức độ cân bằng, cho dù thời gian có tăng thì hàm lượng saponin triterpenoid thu được vẫn không tăng.
Từ kết quả phân tích trên, chúng tôi chọn thời gian trích ly là 120 phút cho quá trình thu nhận saponin triterpenoid bằng nước, giá trị này phù hợp với lợi ích về kinh tế.
56
3.2.4. Tối ưu hóa quá trình trích ly saponin triterpenoid bằng nước Yếu tố khảo sát:
+ Tỉ lệ nguyên liệu : nước (w/v): X1
+ Nhiệt độ trích ly (0C): X2
+ Thời gian trích ly (giờ): X3
Hàm mục tiêu: hàm lượng saponin triterpenoid (mg/100gDW): Y1
Bảng 3.2. Các yếu tố dùng trong RSM
Yếu tố Tên yếu tố Khoảng biến thiên
Mức dưới -1
Tâm 0
Mức trên +1 X1 Tỉ lệ nguyên
liệu:nước (w/v)
1:6 (5:30)
1:7 (5:35)
1:8 (5:40) X2 Nhiệt độ trích ly
(0C)
60 70 80
X3 Thời gian trích ly (phút)
90 120 150
Bảng 3.3. Kế hoạch thực nghiệm theo RSM để tối ưu hóa hàm lượng saponin triterpenoid
Thí nghiệm X1 X2 X3 Thực nghiệm (Y1)
1 1:6 60 90 674,124
2 1:8 60 90 1603,45
3 1:6 70 90 1474,34
4 1:8 70 90 1734,34
5 1:6 60 150 1487,61
6 1:8 60 150 1897,43
7 1:6 70 150 1791,01
8 1:8 70 150 1754,43
9 1:5,32 65 120 1296,09
10 1:8,68 65 120 1954,01
11 1:7 56,59 120 1474,34
12 1:7 73,41 120 1844,61
13 1:7 65 69,54 1504,68
14 1:7 65 170,46 2227,15
15 1:7 65 120 2273,89
16 1:7 65 120 2196,11
17 1:7 65 120 2246,11
57 Phương trình hồi quy có dạng:
Y1 = a0 + a1X1 + a2X2 + a3X3 + a11X12 + a22X22 + a33X32 + a12X1X2 + a23X2X3 + a13X1X3
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các biến đến hàm mục tiêu Hệ số Giá trị Sai số chuẩn P Điều kiện P<0,05
a0 2247,25 58,4729 2,1x10-9 Nhận
a1 195,427 27,4575 0,000191 Nhận
a2 125,514 27,4575 0,00257 Nhận
a3 194,712 27,4575 0,000195 Nhận
a11 -246,46 30,2177 8,06 x10-5 Nhận
a22 -234,292 30,2177 0,000111 Nhận
a33 -161,322 30,2177 0,001077 Nhận
a12 -139,466 35,8768 0,005996 Nhận
a13 -102,011 35,8768 0,024924 Nhận
a23 -96,3382 35,8768 0,0313 Nhận
Mô hình toàn phương bậc 2 đã được xác định bằng phương pháp hồi quy đa biến. Dựa vào Bảng 3.4 thì phương trình bậc 2 thu được như sau:
Y1 = 2247,25 + 195,43X1 + 125,51X2 + 194,71X3 – 246,46X12 – 234,29X22 – 161,32X32 – 139,47X1X2 – 102,01X1X3 – 96,34X2X3
Từ phương trình hồi quy ta nhận thấy các biến X1, X2, X3 có ảnh hưởng tích cực đến hàm lượng saponin triterpenoid thu được, trong khi đó các biến còn lại đều có ảnh hưởng âm đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được.
Bảng 3.5. Phân tích phương sai của mô hình hồi quy Nguồn biến thiên Tổng bình
phương
Bậc tự do
Trung bình bình phương
P
Hồi quy 2,61x106 9 289955 0
Phần dư 72080,2 7 10297,2
Tổng 2,68 x106 16 167605
R2 0,973
Q2 0,799
58
Kiểm tra khả năng giải thích số liệu và dự đoán của mô hình dựa vào các hệ số R2 và Q2, một mô hình hồi quy tốt và có khả năng dự đoán chính xác từ số liệu thực nghiệm khi Q2>0,5 và R2>0,8 và | − | nằm trong khoảng 0,2 đến 0,3. Từ Bảng 3.5 ta được R2 = 0,973 và Q2 = 0,799 thỏa mãn điều kiện vừa nêu [37], kết hợp với P
< 0,05, vì vậy phương trình hồi quy tương thích với số liệu thực nghiệm thu thập được.
Tiến hành tối ưu hóa bằng phần mềm Modde 5, chúng tôi thu được kết quả như sau: hàm lương saponin triterpenoid thu nhận được là 2326,98 mg/100gDW tại điều kiện tối ưu là Tỉ lệ nguyên liệu : nước (X1) = 1:7,3 (w/v), nhiệt độ trích ly (X2)= 65,45 (0C), thời gian trích ly (X3)= 134,87 phút.
Chúng tôi tiến hành thực hiện thí nghiệm kiểm tra theo các thông số tối ưu hóa thì thu nhận được hàm lượng saponin triterpenoid thực nghiệm là: 2374,52 ± 13,66mg/100gDW, kết quả này sai số không quá 5% so với dự đoán của mô hình.
Hình 3.4. Mặt đáp ứng hàm lượng saponin triterpenoid theo tỉ lệ nguyên
liệu:nước và nhiệt độ
Hình 3.5. Mặt đáp ứng hàm lượng saponin triterpenoid theo thời gian và
nhiệt độ