PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ricin 2.3.1.1 Tách chiết ricin từ hạt Thầu Dầu

5 kg hạt Thầu Dầu khô được nghiền nhỏ và ép bằng máy ép thủy lực dưới áp suất cao để loại bỏ dầu, thu được bã hạt Thầu Dầu. Bã hạt Thầu Dầu sau đó được để khô tự nhiên và được ngâm trong axit axetic 5% (với tỷ lệ bã Thầu Dầu : axit acetic 1:10 khối lượng/thể tích). Dung dịch được lắc trên máy lắc với tốc độ 480 vòng/phút trong vòng 6 ÷10h (để qua đêm). Loại bỏ cặn bằng giấy lọc, thu dịch S1.

Kết tủa dịch S1 bằng dung dịch muối (NH4)2SO4 với các nồng độ từ 30% - 70% và xác định nồng độ tối ưu cho quá trình thu protein tổng số từ dịch S1. Kết tủa thu được bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút. Hòa tan kết tủa bằng đệm PBS 0,01M (pH = 7,2). Thẩm tích loại muối (NH4)2SO4 bằng đệm PBS 0,01M thu được dung dịch 1 là dung dịch ricin thô, dung dịch này tiếp tục được sử dụng cho các bước tinh sạch tiếp theo [65].

36

2.3.1.2 Tinh sạch ricin bằng sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn DEAE Sepharose fast flow sử dụng cho phương pháp sắc ký trao đổi ion và Gel Sephadex G-100 dùng cho sắc ký lọc gel .Quá trình tinh sạch ricin gồm 02 bước kế tiếp nhau [77]:

Bước 1: Chạy sắc ký trao đổi ion với gel DEAE Sepharose fast flow

- DEAE được cân bằng ở pH = 8,0 bằng dung dịch đệm Tris - HCl 0,05 M. Lấy một lượng dung dịch 1 thu được cho vào 100 ml gel, khuấy 15 phút để protein bám hoàn toàn vào gel. Đưa toàn bộ gel lên cột thủy tinh kích thước 2,530 cm, rửa cột bằng 100 ml đệm Tris - HCl 0,05 M để ổn định gel. Rửa cột bằng đệm Tris - HCl 0,05 M pH = 8,0 có bổ sung NaCl tăng dần nồng độ từ 0,05 - 1 M với tốc độ 0,2 ml/phút, tiến hành thu mẫu theo phân đoạn (2 ml/phân đoạn).

Bước 2: Chạy sắc ký lọc gel với Sephadex G100

- Gel Sephadex G -100 được hòa tan trong nước cất ở nhiệt độ phòng theo tỉ lệ 1g Sephadex/10 ml H20 trong 4 ÷ 6h (để gel trương nở hoàn toàn). Gel được nạp lên cột thủy tinh đường kính 1,0 cm, chiều cao cột 30 cm và được ngâm trong dung dịch đệm photphat 0,02 M (pH =7,2).

- Quá trình sắc ký trên cột theo tỉ lệ : mẫu/gel = 1/6 (tính theo thể tích) tốc độ dòng là 0,2 ÷ 0,3 ml/phút và thu 20 phân đoạn (5 ml/mỗi phân đoạn).

2.3.2. Các phương pháp xác định ricin 2.3.2.1 Xác định hàm lượng protein

Xác định hàm lượng protein trong các phân đoạn bằng phương pháp Lowry [9].

2.3.2.2 Xác định độ tinh sạch của ricin bằng phương pháp điện di

Độ tinh sạch của ricin được xác định bằng cách điện di trên gel polyacrylamide theo phương pháp của Laemmli trên thiết bị của hãng Hoefer (Mỹ).

Bản gel được nhuộm màu bằng Coomassie Blue và đọc kết quả trên hệ thống phân tích ảnh của Biorad [78].

2.3.2.3 Phân tích khối phổ xác định ricin (LC-MS/MS)

Protein sau tinh sạch được xác định bằng phương pháp LC-MS/MS. Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân bằng trypsin được hòa vào 0,1% FA và phân tích trên hệ

37

Nano LC trong 90 phút. Ghi phổ Nano LC-ESI- MS/MS. Máy khối phổ Bruker Daltonics quét phổ TOF MS đơn đối với các ion nằm trong dải khối từ 100 amu đến 4000 amu sang khối phổ liên tiếp (MS/MS). Phần mềm FlexAnalysis v3.4 lựa chọn các ion peptide để tiến hành phân mảnh MS/MS. Phổ khối MS/MS được phân tích bằng phần mềm Mascot v1.8 (Matrix Science Ltd., London, Anh) và Ngân hàng Dữ liệu Protein NCBI (Mỹ).

Các thông số cài đặt:

+ Cơ sở dữ liệu: NCBI.

+ Sai số khối peptide và MS/MS:0,6 Da và 1,2 Da.

+ Cải biến cố định: carbamindomethyl (C).

+ Điện tích của peptide: +2, +3 hoặc+4.

+ Cải biến biến đổi: oxidation (methyonine, M).

+ Enzyme: trypsin.

2.3.2.4 Phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện ricin

Sử dụng test phát hiện nhanh độc tố ricin theo nguyên lý sắc ký miễn dịch để đối chứng, so sánh với quá trình tách chiết và tinh sạch, phát hiện ricin theo phương pháp ELAA và real-time PCR. Test phát hiện nhanh ricin bằng nguyên lý sắc ký miễn dịch được cung cấp bởi Viện Hóa học Môi trường quân sự [7] như sau:

Phần 1: Chuẩn bị mẫu

Mẫu môi trường có thể là dung dịch hoặc thể rắn (dạng bột). Việc chuẩn bị mẫu kiểm tra sự có mặt của ricin trong các đối tượng mẫu được tiến hành như sau:

1. Xác nhận lại hạn sử dụng của bộ Test phát hiện độc tố ricin in trên bề mặt túi nhôm vẫn trong hạn sử dụng.

2. Xé túi nhôm đựng bộ Test phát hiện ricin, lấy lọ nhựa chứa dung dịch hòa tan mẫu và que lấy mẫu có trong bộ Test.

3. Cho đầu tăm bông thấm ướt dung dịch mẫu kiểm tra rồi đưa vào lọ dung dịch hòa tan mẫu và khuấy đều (lặp lại 2 đến 3 lần). Dung dịch có nồng độ ricin lớn hơn 50 ng/ml đều được phát hiện.

38

4. Nếu mẫu độc là chất rắn, hãy thấm ướt que lấy mẫu bằng dung dịch hòa tan mẫu, sau đó cho vào lọ dung dịch hòa tan và khuấy đều (lặp lại 2 đến 3 lần).

Các dung dịch thu được nói trên sẵn sàng để kiểm tra sự có mặt ricin trong môi trường.

Phần 2: Các bước thực hiện

- Bước 1: Lấy thanh strip từ trong túi nhôm được bảo vệ bằng silicagel ra ngoài để tiến hành kiểm tra độc tố ricin.

- Bước 2: Lấy micropipet có trong túi, hút mẫu từ lọ dung dịch mẫu kiểm tra, nhỏ 2- 3 giọt vào giếng mẫu (S) trên thanh strip, đặt thanh strip ở vị trí thăng bằng.

- Bước 3: Đợi cho dung dịch thấm đều dọc thanh strip và đọc kết quả sau thời gian ít nhất là 10 phút.

- Bước 4: Kết thúc kiểm tra, thu toàn bộ các dụng cụ thử nghiệm cho vào túi đựng TEST và dán nhãn báo “ Nguy hiểm sinh học”.

Phần 3: Đọc kết quả

Dương tính: Trên thanh strip xuất hiện hai vạch màu tại vị trí T và C cho phép kết luận trong mẫu có chứa độc tố ricin.

Âm tính: Trên thanh strip chỉ xuất hiện một vạch màu tại vị trí C cho phép kết luận trong mẫu không chứa độc tố ricin.

Trường hợp test hỏng: Trên thanh strip không thấy xuất hiện vạch màu hoặc xuất hiện chỉ một vạch màu tại vị trí T cho phép kết luận TEST phát hiện độc tố ricin đã bị hỏng hoặc quá hạn sử dụng.

Giới hạn phát hiện: lớn hơn 50 ng/ml với độ tin cậy 98%.

2.3.2.5 Xác định hàm lượng ricin tương đối dựa trên test phát hiện nhanh

Do chưa có phương pháp định lượng ricin nên hàm lượng ricin được định lượng tương đối bằng 50 ng/ml sử dụng test phát hiện nhanh ricin dựa trên ngưỡng phát hiện của test (50 ng/ml) và độ pha loãng cuối cùng của các phân đoạn vẫn cho kết quả dương tính với ricin để xác định ricin trong quá trình tách và tinh sạch.

2.3.2.6 Xác định ricin bằng phương pháp Western blot, dot blot

Sau khi điện di SDS-PAGE, protein từ gel được chuyển sang màng PVDF nhờ hệ thống chuyển màng trong 20 phút với hiệu điện thế 15V, màng được phủ bằng

39

skim milk 5% trong PBS qua đêm, rửa 3 lần bằng đệm TTBS và TBS, ủ màng với kháng thể 1 kháng ricin của thỏ pha loãng 5.000 lần với sữa 5% trong TBS trong 2 giờ. Rửa màng và phủ với kháng thể 2 kháng kháng thể IgG thỏ cộng hợp enzyme peroxidase pha loãng 10.000 lần trong 2 giờ. Cuối cùng rửa màng bằng TTBS, dung dịch TBS và hiện màu bằng dung dịch TMB [120].

Các bước thực hiện phản ứng Dot blot: Mẫu được nhỏ lên màng PVDF (chấm điểm), và màng được phủ bằng dung dịch khóa màng (blocking) trong 1 giờ.

Sau đú rửa bằng đệm TBST rồi ủ với 100 àl dung dịch aptamer đó được biotin húa trong 1 giờ ở 370C. Màng tiếp tục được rửa 3 lần bằng đệm TTBS và thêm vào mỗi điểm 100 àl dung dịch streptavidin-horseradish peroxidase. Sau khi ủ 1 giờ, màng tiếp tục được rửa 3 lần với dung dịch đệm bằng đệm TTBS và thờm 100 àl dung dịch TMB, ủ 10 phút tại nhiệt độ phòng, trong tối. Dừng phản ứng bằng cách đổ H2O vào khay nhuộm màng và ngâm trong 2 phút. Phản ứng dương tính khi có màu xuất hiện tại điểm chấm mẫu.

Quy trình tách chiết và tinh sạch ricin được thể hiện bằng hình 2.1.

40

2.3.3 Phương pháp SELEX cải tiến sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin

Quy trình SELEX được thực hiện có cải biến theo Tuerk C và Gold L [123].

Trong quá trình thực hiện, chúng tôi đã cải tiến quy trình SELEX bằng cách sử dụng cột sàng lọc Nanosep 5K Omega của Pall Corporation với chất mang hỗn hợp ricin-aptamer là hạt nhựa Q sepharose fast flow. Cột có thiết kế màng lọc với giới hạn cho các phân tử protein đi qua là 30 kDa, với các base đơn là 50-95 base có thể đi qua cột. Điều này cho phép các phân tử ricin và phức hợp ricin - aptamer được giữ lại trên cột, các aptamer không gắn kết với ricin sẽ đi ra khỏi cột. Tiếp theo là quá trình rửa giải bằng hợp chất phù hợp để phá vỡ liên kết ricin - aptamer, các aptamer sẽ bị đẩy ra khỏi cột. Thu các aptamer này lại, tiến hành phản ứng PCR để

Hình 2.1: Quy trình tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt Thầu Dầu

41

nhân các aptamer đặc hiệu ricin và tiếp tục đưa vào vòng sàng lọc tiếp theo. Các bước cụ thể như sau:

2.3.3.1 Chuẩn bị thư viện ssDNA thứ cấp

* PCR thư viện TV40:

Thư viện TV40 được cung cấp bởi phòng Công nghệ tế bào động vật/Viện Công nghệ Sinh học. Thư viện thứ cấp được tạo ra bằng phương pháp PCR và tạo thư viện sợi đơn (ssADN) bằng cặp mồi lệch. Quá trình PCR được thực hiện với khuôn là: thư viện gốc, cặp mồi ApF2/ApR2 với tỷ lệ cặp mồi lệch từ 1:1 đến 1:1/40 cùng các nguyên liệu của phản ứng PCR. Tiến hành tạo thư viện thứ cấp theo chu trình nhiệt như sau: biến tính ở 94oC trong 3 phút, lặp lại 20 chu kỳ theo chu trình sau: 94oC: 45 giây; 55oC: 45 giây; 72oC: 1 phút; kéo dài chuỗi ở 72oC: 8 phút.

Sản phẩm PCR được dùng để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

* Tủa ADN sợi đơn:

ADN sợi đơn được tủa bằng ethanol và EDTA để thu lại. Các bước thực hiện như sau:

+ 15 μL EDTA 125 mM và 180 μl ethanol 100% được thêm vào mỗi ống mẫu, giữ ở -20oC qua đêm.

+ Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút, loại dịch nổi, thu cặn.

+ Thêm 180 μl ethanol 70% vào mỗi ống mẫu, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Loại dịch nổi, thu cặn và làm khô hoàn toàn.

+ Hòa lại mẫu trong đệm gắn bản.

2.3.3.2 Gắn kết aptamer và Q sepharose fast flow:

+ Hỗn hợp ADN sợi đơn được hũa trong 300 àl đệm SB (2 mM MgCl2; 50 mM Tris-HCl pH 7,4; 250 mM NaCl), trộn đều.

+ Biến tớnh 30 àl aptamer ở 95oC, 10 phỳt, sau đú đặt nhanh vào đỏ 5 phỳt.

+ Bổ sung 30 àl aptamer đó biến tớnh vào 75 àl PBSM, sau đú bổ sung tiếp 7 àl ricin (100 àg/ml), trộn đều hỗn hợp, để hỗn hợp ở nhiệt độ phũng 4 giờ.

+ Ủ tiếp với 2 ml Q Sepharose fast flow (đã được cân bằng trong PBSM) trong 2h.

42

+ Đưa hỗn hợp lên cột NANOSEP 5K OMEGA, ly tâm 3.000 vòng/phút trong 5 phút.

2.3.3.3 Rửa, giải hấp và thu sản phẩm:

+ Bổ sung 1,5 ml đệm rửa (SB + 0,1% Tween-20) lên cột, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 15 phút, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch (giữ lại dịch để kiểm tra nồng độ), lặp lại 3 lần.

+ Rửa tiếp 3 lần, mỗi lần với 1,5 ml đệm rửa, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 10 phút, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch (giữ lại dịch để kiểm tra nồng độ).

+ Giải hấp: bổ sung 1 ml DMSO lên cột, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 20 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch để kiểm tra nồng độ và sử dụng làm nguồn ADN để tiến hành phản ứng PCR và đưa vào vòng sàng lọc tiếp theo với các bước như trên. Các vòng sàng lọc sau lượng Tween- 20 tăng dần lên tới 0,5% để loại dần các aptamer có ái lực liên kết yếu với ricin. Ngoài ra, tiến hành sàng lọc 01 vòng sàng lọc ngoại trừ. Vòng sàng lọc loại trừ sử dụng hạt Q sepharose fast flow không gắn ricin, thu dịch aptamer không gắn với hạt Q sepharose fast flow.

Để theo dõi quá trình làm giàu của các phân tử gắn đặc hiệu với ricin trong suốt quá trình sàng lọc, thư viện đưa vào và sản phẩm thu được sau giải hấp của mỗi vòng được đo nồng độ trên máy NanoDrop 1000 ở bước sóng 260 nm. Quá trình sàng lọc sẽ dừng lại khi lượng sản phẩm giải hấp của những ADN đặc hiệu ricin đạt 55-60% so với thư viện đưa vào. Trình tự ADN thu được sau vòng sàng lọc cuối cùng được sử dụng để tách dòng và giải trình tự.

43

2.3.4. Các phương pháp sử dụng để chọn lọc aptamer

Aptamer thu được sau vòng sàng lọc loại trừ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR, sản phẩm PCR sau đó được gắn vào vector tách dòng pBT2.1 và pCR2.1, biến nạp và chọn dòng trong vi khuẩn E. coli chủng DH5α. Quá trình tách dòng và chọn lọc dòng aptamer được tiến hành theo hình 2.3.

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình sàng lọc Aptamer đặc hiệu ricin bằng cột NANOSEP 5K OMEGA

44 2.3.4.1. Phương pháp khuếch đại gen bằng PCR

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp) là phương pháp được sử dụng trong quá trình khuếch đại các ADN đặc hiệu ricin sau các vòng sàng lọc. Sản phẩm sau sàng lọc được tiến hành nhân bản với cặp mồi ApF2/ApR2 sử dụng PCR master Mix của hãng Invitrogen, tiến hành theo chu trình: bước 1: biến tính 940C trong 3 phút; bước 2: chu trình lặp lại 30 chu kỳ (940C trong 30 giây, 580C trong 30 giây, 72oC trong 30 giây); bước 3: hoàn thiện sản phẩm ở 72oC trong 5 phút; bước 4: làm mát sản phẩm PCR ở 8-100C.

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tách dòng và chọn lọc aptamer đặc hiệu ricin

45 2.3.4.2 Phản ứng gắn ADN vào vector tách dòng

Để phân tách các sợi aptamer sau sàng lọc, các aptamer được nhân bản, sau đó gắn vào vector tách dòng. Vector tách dòng được sử dụng là vector pCR2.1- TOPO (Invitrogen) và pBT (viện Công nghệ sinh học) dùng để gắn trực tiếp sản phẩm phản ứng PCR. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng:

3 àl H2O vụ trựng + 1 àl dung dịch đệm T4- ligase +3 àl sản phẩm PCR + 2 àl vector pCR2.1 đó mở vũng + 1 àl T4-ligase. Phản ứng được ủ 140C qua đờm đảm bảo nhiệt độ cho T4- ligase hoạt động.

2.3.4.3 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E.coli DH5α

Sản phẩm PCR sau khi gắn vào vector tách dòng được biến nạp vào vi khuẩn E.coli nhằm tách riêng các plasmid. Phương pháp biến nạp thực hiện trong đề tài là hóa biến nạp: dựa vào tác dụng của CaCl2 khiến thành tế bào vi khuẩn đang trong thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp hơn, tạo điều kiện cho ADN chui vào qua lỗ màng khi tiến hành sốc nhiệt. Quy trình thực hiện được trình bày cụ thể như sau:

- Lấy chủng tế bào được cất ở - 20oC, cấy vạch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc, ủ đĩa cấy qua đêm ở 37oC. Nhặt một khuẩn lạc đem nuôi cấy trong 2ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc ở 37oC qua đêm.

- Cấy chuyển 1% dịch nuôi tế bào qua đêm sang môi trường LB mới. Nuôi lắc ở 37oC đến khi OD600 đạt 0,5-0,7. Chuyển dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút. Ly tâm thu tế bào ở 4oC, 4000 vòng/phút trong 5 phút.

Loại dịch nổi, hũa tan cặn tế bào trong 300 àl CaCl2 0,1 M, đặt trong đỏ 10 phút. Ly tâm ở 4oC, 4000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch nổi. Hòa tan tủa trong 100 àl (CaCl2 0,1 M, glycerol 30%), giữ ở - 80oC.

Biến nạp: Lấy tế bào khả biến giữ trong tủ - 80oC ra, đặt trên đá khoảng 30 phút. Bổ sung dung dịch sau phản ứng gắn vào ống eppendorf chứa tế bào khả biến, đặt trong đá 30 phút. Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây, sau đó đặt ngay ống tế bào vào đỏ để trong 5 phỳt. Bổ sung 100 àl mụi trường LB, nuụi lắc 200 v/ph ở 37oC trong 1 giờ. Cấy trải dịch tế bào trên môi trường LB (đã bổ sung Ampicilin 100 mg/l, IPTG 100 àM và X-gal 40 mg/ml). Nuụi ở tủ ấm qua đờm ở 37oC, ADN plasmid

46

được tách chiết lại từ tế bào vi khuẩn đã biến nạp và kiểm tra bằng cách cắt với enzymee giới hạn, với pCR2.1 là EcoRI và pBT là BamHI.

2.3.4.4 Chọn dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp

Chọn dòng tế bào là bước kiểm tra sự hiện diện của đoạn ADN mong muốn.

Các đĩa petri sau khi ủ từ 16-20 h sẽ tạo các khuẩn lạc riêng rẽ. Các khuẩn lạc này có mang ADN mong muốn hay không được kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc như sau:

Thành phần phản ứng PCR gồm: 12,5 àl Dream taq master mix, 1 àl ApF2 10 pM, 1 àl ApR2 10pM, 10.5 àl H2O.

Dùng tăm vô trùng nhặt các khuẩn lạc trên đĩa thạch và nhiễm vào ống PCR có chứa các thành phần của phản ứng. Các plasmid được tách chiết bằng kít tách plasmid của QIA gen và tách chiết theo phương pháp của Sambrok và cộng sự. Chu kỳ nhiệt: bước 1: biến tính 94oC trong 3 phút; bước 2: chu trình lặp lại 30 chu kỳ (94o C trong 30 giây, 58o C trong 30 giây, 72o C).

Quy trình tách dòng các plasmid tái tổ hợp từ vi khuẩn E.coli theo phương pháp mini-prep của Sambrook như sau [Green M.R and Sambrook J, 2015]:

Hóa chất:

Dung dịch I: thành phần trong 100 ml: Tris 1M pH 8,0: 25,0 ml; EDTA 0,5 M: 2,0 ml; 1 M Glucose: 5,0 ml, nước cất: 68 ml.

Dung dịch II: thành phần trong 1 ml: 50 àl 20% SDS; 20 àl 10 N NaOH;

nước cất: 930 àl.

Dung dịch III: thành phần trong 100 ml: KOAc 5 M: 60 ml, axit acetic:

11,5 ml, nước cất: 28,5 ml.

Các bước thực hiện: Nuôi tế bào trong môi trường LB lỏng: lấy một khuẩn lạc từ đĩa petri nuụi trong 2 ml mụi trường LB lỏng cú bổ sung ampicilin 100 àg/ml, nuôi lắc ở 37oC, 200 vòng/phút.

Hũa tế bào trong 150 àl dung dịch I, bổ sung 150àl dung dịch II, lắc nhẹ ống nghiệm. Tiếp tục bổ sung 150 àl dung dịch III, lắc đều ống nghiệm, để ở trong đỏ 10 phút, ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 15 phút.