Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp tách protein từ hạt Thầu Dầu bằng dung dịch axit acetic và kết tủa phân đoạn bằng muối (NH4)2SO4, kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả tách protein từ hạt Thầu Dầu bằng muối (NH4)2SO4
Dịch protein Thể tích tổng (ml)
Nồng độ protein (mg/ml)
Nồng độ protein tổng số
(mg) Protein tổng trong axit acetic
(5%) 300 2,25 675
Tủa protein với (NH4)2SO4 30% 41 5,73 234,9 Tủa protein với (NH4)2SO4 40% 44 6,05 266,2 Tủa protein với (NH4)2SO4 50% 47 7,62 358,1 Tủa protein với (NH4)2SO4 60% 50 8,59 429,5 Tủa protein với (NH4)2SO4 70% 53 7,82 414,4
Kết quả phân tích cho thấy từ 30 g hạt Thầu Dầu chiết bằng 300 ml dung dịch axit acetic, sau khi kết tủa bằng dung dịch (NH4)2SO4 với các tỉ lệ 30%, 40%, 50%, 60% và 70% và thẩm tích loại muối, thể tích thu được lần lượt là 41, 44, 47, 50 và 53 ml. Kết quả cho thấy khi sử dụng (NH4)2SO4 60%, hàm lượng protein thu được cao nhất. Điện di dịch chiết protein thu được trên gel SDS - PAGE (Hình 3.1a) và kiểm tra bằng Western blot sự có mặt của ricin trong mẫu (Hình 3.1b). Kết quả cho thấy hàm lượng protein cao nhất khi kết tủa protein với dung dịch (NH4)2SO4 60%, khi băng kích thước 64 kDa (được dự đoán là ricin) là đậm nhất tại đường chạy protein khi kết tủa với dung dịch (NH4)2SO4 60%.
59
Hình 3.1: Điện di đồ SDS-PAGE (3.1 a) và Western blot của quá trình tách chiết ricin (b). 1- dịch chiết từ bã hạt Thầu Dầu; M - marker protein; 2,3,4,5,6 - tủa bằng dung dịch (NH4)2SO4 nồng độ 30%, 40%, 50%, 60% và 70%.
Tiến hành kiểm tra sự có mặt của ricin trong các dung dịch protein thu được sau khi tủa bằng test phát hiện nhanh ricin, kết quả được trình bày trong bảng 3.2:
Bảng 3.2: Kết quả xác định ricin trong các dung dịch protein sau tủa muối Protein
tổng (àg/ml)
Độ pha loãng
(NH4)2SO4 30%
(NH4)2SO4 40%
(NH4)2SO4 50%
(NH4)2SO4 60%
(NH4)2SO4 70%
570 10-1 + + + + +
57 10-2 - + + + +
5,7 10-3 - - - + +
0,57 10-4 - - - - -
Ghi chú: +: Dương tính; -: Âm tính
Với ngưỡng phát hiện ricin của test là 50 ng/ml, sau khi pha loãng 1.000 lần từ dịch chiết thu được cho thấy với phân đoạn kết tủa 60% và 70% vẫn thấy sự hiện diện của ricin trong khi các nồng độ khác không phát hiện được. Điều này chứng tỏ tại các nồng độ muối 60% và 70% cho hiệu suất thu hồi ricin cao nhất. Từ các kết quả thu được, có thể khẳng định nồng độ muối (NH4)2SO4 tốt nhất để tủa dịch chiết I là 60% (m/v). Kết quả nghiên cứu thu được tương tự với Kumar và cộng sự sử dụng kết hợp tách ricin bằng nước cất bổ sung axit đến pH 4 và kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 với kết quả tách được lượng protein tổng số có ricin chiếm khoảng
3.1a 3.1b
60
0,12% khối lượng của hạt Thầu Dầu [77]. Trong một nghiên cứu khác, Thomas và cộng sự sử dụng axit acetic 5% để tách ricin qua 2 bước, tiếp theo là kết tủa phân đoạn bằng dung dịch (NH4)2SO4 100% kết hợp ly tâm 10.000 vòng/phút, kết quả cũng tách thành công ricin với hiệu suất tương đối cao [121]. Một nghiên cứu khác của Jang và Kim cũng sử dụng axit acetic 5% và 02 lần kết tủa phân đoạn với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ 30% và 60% kết hợp ly tâm thẩm tích để tách thành công ricin từ hạt Thầu Dầu [65]. Từ các kết quả trên, chúng tôi tiếp tục sử dụng dung dịch (NH4)2SO4 60% để kết tủa protein từ dịch chiết I. Dịch thẩm tích sau loại muối được sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình tinh sạch tiếp theo (dung dịch 1).
3.1.2 Kết quả tinh sạch ricin
Tiến hành tinh sạch dung dịch 1 thu được ở trên bằng các phương pháp sắc ký, sử dụng 02 loại gel là DEAE- sepharose fast flow (sắc ký trao đổi ion) và sephadex G-100 (sắc ký lọc gel) để tinh sạch ricin qua 02 bước, kết quả thu được như sau:
3.1.2.1 Tinh sạch ricin bằng sắc ký trao đổi ion
Thực hiện tinh sạch ricin bằng gel DEAE - sepharose fast flow thu được các kết quả được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả xác định ricin trong các phân đoạn chạy sắc ký trao đổi ion Độ
pha loãng
Protein tổng (àg/ml)
Hàm lượng ricin tương đối
(àg/ml)
PĐ7 PĐ8 PĐ9 PĐ10 PĐ11 PĐ12
10-1 437 50 + + + + + +
10-2 43,7 5 - + + + + +
10-3 4,37 0,5 - - + + + -
10-4 0,437 0,05 - - + + - -
10-5 0,0437 0,005 - - - -
Ghi chú: +: Dương tính; -: Ẩm tính
Kết quả kiểm tra cho thấy ricin xuất hiện nhiều nhất tại 4 phân đoạn 8, 9, 10 và 11, đặc biệt tại 02 phân đoạn 9 và 10, test phát hiện nhanh vẫn cho kết quả
61
dương tính khi pha loãng 10.000lần với ước tính lượng ricin tương đối tại các phân đoạn 9 và 10 là cao nhất. Gộp 02 phân đoạn 9 và 10 lại (Dung dịch 2), kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE, kết quả được trình bày ở hình 3.2 và 3.3.
Hình 3.2: Sắc đồ rửa giải ricin trên cột sắc ký trao đổi ion
Kích thước cột: 2,530 cm; Đệm chạy: Tris - HCl 0,05 M; Tốc độ chảy: 0,2 ml/phút, Thu phân đoạn: 2ml; Dung dịch rửa giải: Tris - HCl 0,05 M + NaCl 0,05 - 1M
Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch sau khi chạy sắc ký trao đổi ion (1): Dung dịch 1, trước khi chạy cột; (2): Marker protein;
(3): Dịch thu được sau khi qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE (phân đoạn 9+10)
62
So sánh hàm lượng protein của các phân đoạn đã tinh sạch từ sắc ký đồ (Hình 3.2) cho thấy hàm lượng protein cao nhất ở phân đoạn 9 và 10. Điều này cũng phù hợp với 02 phân đoạn có hàm lượng ricin cao nhất. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy sản phẩm sau sắc ký còn 02 băng protein tương đối rõ tại vị trí 64 kDa và 35kDa. Điều này chứng tỏ qua quá trình chạy sắc ký trao đổi ion vẫn còn một số loại protein khác có cùng một số đặc tính hóa lý như ricin nhưng khác nhau về khối lượng phân tử. Do vậy, cần tiếp tục tinh sạch ricin bằng phương pháp sắc ký lọc gel để phân tách các protein theo khối lượng nhằm thu được ricin dạng tinh sạch.
3.1.2.2 Tinh sạch ricin bằng sắc ký lọc gel
Dựa vào khối lượng phân tử của ricin là khoảng 65 kDa nên nhóm nghiên cứu sử dụng gel sephadex G-100 để phù hợp với khối lượng phân tử của ricin. Kết quả tách phân đoạn được trình bày trong hình 3.4.
Hình 3.4: Sắc ký đồ tinh sạch ricin bằng sắc ký lọc gel Kích thước cột: 1x30 cm
Đệm sử dụng: Photphat 0,02 M (pH =7,2) Tốc độ chảy: 0,2 ml/phút; Thu phân đoạn: 4 ml.
63
Bảng 3.4: Kết quả xác định ricin trong các phân đoạn chạy sắc ký lọc gel Hàm
lượng protein (àg/ml)
Hàm lượng ricin tương
đối (àg/ml)