1.4.1. Nấm mốc Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae là loại nấm thuộc Họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, Lớp Eurotino-mycetes, ngành Ascomycota. Cơ thể của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 m, phân nhánh nhiều và có vách ngang chia sợi thành nhiều tế bào (nấm đa bào).
Nấm mốc Aspergillus oryzae là loài nấm sợi quan trọng trong công nghiệp, đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm lên men từ đậu tương phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam và các nước châu Á hàng trăm năm nay. Nó được sử dụng để tạo các sản phẩm như sake, nước chấm, tương... Nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, có chứa nhiều enzyme thủy phân nhƣ amylase, protease, lipase, hemicellulase, cellulase, oxyreductase, phytase, pectinesterase…, không sinh độc tố aflatoxin (M. Machida, 2005) [17] nên đƣợc phép sử dụng trong sản xuất thực phẩm.
1.4.2. Các phương pháp nuôi cấy nấm mốc sản xuất enzyme [9]
Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Trong phương pháp nuôi cấy này người ta cho vi sinh vật phát triển và bao phủ trên bề mặt các hạt chất dinh dưỡng rắn đã được làm ẩm dùng làm môi trường. Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh nên ít bị tạp nhiễm. Môi trường được làm có diện tích tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Phải
24
đảm bảo cho hàm lƣợng tinh bột trong khối nguyên liệu không đƣợc thấp hơn 20% có thể bổ sung thêm nguồn nitơ, nguồn cacbon, phốt pho và các chất kích thích sinh trưởng. Với phương pháp này nồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lƣợng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản. Tuy nhiên, phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lƣợng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.
Phương pháp nuôi cấy chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với cơ chất chủ yếu là tinh bột.
Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucose, saccharose. Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm gồm:
chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy mốc giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất.
Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự động hóa năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chon tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu đƣợc tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh vô trùng. Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không đảm bảo vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, gây thiệt hại lớn [9].
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae trong nuôi cấy bề mặt [9]
Ảnh hưởng của nhiệt độ
25
Nhiệt độ có vai trò chủ yếu trong sự sinh trưởng, sản sinh bào tử và sự nảy mầm của sợi nấm của chúng. Theo đó, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành men của A.oryzae là ở khoảng 28 – 32oC. Nếu nhiệt độ xuống dưới 24oC hay cao hơn 36oC thì nấm mốc sẽ phát triển chậm do đó làm giảm quá trinh sinh tổng hợp enzyme.
Tuy nhiên, trong quá trình sinh trường, nhiệt lượng do nấm mốc tỏa ra mạnh nhất ở giờ thứ 14 đến 19 (chiếm ẵ toàn bộ lượng nhiệt tỏa ra), khiến mụi trường cú thể bị núng lên 40oC hoặc hơn [3]. Vì vậy cần giữ cho nhiệt độ môi trường ổn định và trong khoảng từ 24oC đến không quá 36oC.
Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến sinh trưởng và sản sinh bào tử của nấm mốc mà còn tác động lên sự trao đổi chất của chúng, đặc biệt là lên số lƣợng và chất lƣợng của các chất tạo thành. Nhƣng không phải bao giờ nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trưởng cũng là thích hợp nhất cho sự tạo thành tất cả các sản phẩm trao đổi chất.
Ảnh hưởng của độ ẩm
Mọi quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật đều xảy ra trong môi trường nước. Tuy nhiên nhu cầu về nước đối với từng loài, từng chủng và thời kỳ phát triển khác nhau có khác nhau. Trong những nhân tố tác động vào sự phát triển của nấm mốc, độ ẩm có ảnh hưởng lớn. Ảnh hưởng này thể hiện không chỉ ở sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và sự sinh sản bào tử mà còn đặc biệt ở sự nảy mầm của bào tử.
Theo các nghiên cứu thì độ ẩm của môi trường tốt nhất cho sự hình thành men của nấm mốc là khoảng 55% - 60%. Độ ẩm thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45%. Cần giữ cho độ ẩm không bị ẩm trong quá trình phát triển. Nếu độ ẩm trên 60% dễ nhiễm khuẩn, khó thông khí, ở độ ẩm 45 - 50% khi nuôi cấy môi trường bị khô nhanh do đó làm giảm hoạt tính khi sinh tổng hợp enzyme. Độ ẩm tương đối của không khí thích hợp cho phát triển là từ 80% đến bão hòa. Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường khỏi khô.
26
Jarun Chutmanop và cộng sự (2008) đã nghiên cứu về khả năng sinh protease của nấm mốc A.oryzae khi nuôi cấy bề mặt trên môi trường có chất nền là cám gạo Thái . Theo đó, khi nuôi cấy trên 20g môi trường cám mì trộn cám gạo Thái tỉ lệ 1:2, nhiệt độ 50oC, 0,06 g nấm mốc với độ ẩm lần lƣợt 45%, 50%, 55%, 60%, hàm lƣợng protease đạt cao nhất tại độ ẩm 50% (1256 đv/g chất khô).
Ảnh hưởng của độ thoáng khí
A.oryzae là loài hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường trong điều kiện đầy đủ oxy. Chandran Sandhya và cộng sự (2005) [15] đã tiến hành so sánh đánh giá khả năng sản xuất protease của bảy chủng nấm mốc trong đó có ba chủng A.oryzae và nhận thấy trong các môi trường nuôi cấy chìm và nuôi cấy bề mặt với chất nền lần lượt là cám lúa mì, trấu, cám gạo, ngũ cốc, bánh dầu dừa, bánh nhân cọ, bánh mè, bột hạt mít và bánh dầu ô liu, cám lúa mì là chất nền tốt nhất để A.oryzae cho protease hoạt tính cao. Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy bề mặt với chất nền cám lúa mì cho hoạt lực enzyme là 31,2 đv/g, gấp 3,5 lần so với môi trường nuôi cấy chìm tương ứng là 8,7 đv/g. Như vậy, để đáp ứng điều kiện thoáng khí cho sự sinh trưởng và phát triển của A.oryzae môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5 - 3,0 cm, phòng nuôi phải thoáng.
Ảnh hưởng của pH
Jarun Chutmanop và cộng sự (2008) [16] đã nghiên cứu về khả năng sinh protease của nấm mốc A.oryzae khi nuôi cấy bề mặt trên môi trường có chất nền là cám gạo Thái . Theo đó, khi nuôi cấy trên 20g môi trường cám mì trộn cám gạo Thái tỉ lệ 1:3, với độ ẩm 50%, nhiệt độ 50oC, 0,06 g nấm mốc, hàm lƣợng protease đạt cao nhất tại pH 7,5 (gần 1000 đv/g chất khô), cao hơn 30% so với trường tương tự nhưng với pH 5,5.
27
Môi trường thích hợp cho A.oryzae là môi trường acid yếu, pH trong khoảng 5,5- 6,5[10]. Môi trường bã đậu tự nhiên đã có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi nấm mốc
Thời gian nuôi nấm mốc cũng là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Tuy nhiên yếu tố này còn phụ thuộc vào nhiệt độ và môi trường nuôi cấy.
Natália Lima de Oliveira Pascoal và cộng sự (2014) [19] đã nghiên cứu về khả năng sinh enzyme protease của nấm mốc A.oryzae khi nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn với chất nền là khô dầu hạt cải (100g khô dầu với 40ml nước) trong điều kiện tĩnh, nhiệt độ 20oC, tỉ lệ nấm mốc 107 TB/g trong 96 giờ và nhận thấy các chủng A.oryzae đƣợc nghiên cứu đều sinh enzyme protease sau 48 giờ nuôi cấy với hoạt độ cao nhất đạt đƣợc ở 72 giờ sau nuôi cấy.
Chuenjit Chancharoonpong và cộng sự (2012) [14] đã nghiên cứu quá trình sản sinh enzyme và sinh trưởng của nấm mốc A. oryzae trong lên men đậu nành làm koji và cho thấy trong điều kiện nuôi cấy trên môi trường rắn, A.oryzae có amylaza hoạt động cực đại từ 72 giờ sau nuôi cấy, còn protease có hoạt lực cực đại từ 48 giờ sau nuôi cấy.
Quản Lê Hà và cộng sự (2011) [2] đã nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae trên môi trường đậu đen, ở điều kiện nhiệt độ 30oC và tương ứng với độ ẩm 51% thì cho thấy: Hoạt độ protease đạt cực đại sau 30 giờ nuôi mốc và giảm dần nếu tiếp tục nuôi mốc; tại thời điểm 54 giờ thì hoạt độ giảm 2 lần, và tại thời điểm 60 giờ thì giảm 2,4 lần.
.
28