3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy A.oryzae trên môi trường bã đậu, để tăng thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy, tiến hành nghiên cứu bổ sung bột mỳ vào nguyên liệu bã đậu, tỷ lệ bột mỳ đƣợc bổ sung là 0%, 5%, 10%, 15% với điều kiện nuôi cấy: Độ ẩm môi trường: 60%, nhiệt độ nuôi: 30oC, thời gian nuôi: 48 giờ, số tế bào: 22.103/ g môi trường. Kết quả được thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần nguyên liệu đến hoạt độ protease
53
Kết quả trên hình 3.1 cho thấy khi tăng tỷ lệ bột mỳ được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm mốc A.oryzae từ 0 đến 10% thì hoạt độ enzyme protease tạo thành tăng, tuy vậy khi tỷ lệ bột mỳ lên đến 15% thì hoạt độ protease tạo thành lại giảm mạnh.
Điều này có thể lý giải được là do môi trường bổ sung 15% bôt mì làm thay đổi tỉ lệ nguồn nitơ, cacbon, các nguồn dinh dƣỡng khác của cả khối bã không đáp ứng điều kiện thích hợp cho sự sản sinh enzyme protease của nấm A.oryzae. Có thể thấy ở tỷ lệ bột mỳ 10%, hoạt độ enzyme protease đạt cao nhất, còn ở tỷ lệ bột mỳ 5% hoạt độ enzyme protease tạo thành tuy thấp hơn nhƣng không nhiều so với ở tỷ lệ bột mỳ bổ sung 10%. Vì vậy để tận dụng lƣợng bã đậu đƣợc sử dụng, chúng tôi chọn thành phần nguyên liệu để nuôi cấy A.oryzae là 5% bột mỳ và 95% bã đậu nành.
3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu thay đổi độ ẩm môi trường lần lượt là 50%, 55%, 60%, 65% với môi trường bã đậu bổ sung 5% bột mỳ, nhiệt độ nuôi: 30oC, thời gian nuôi: 48 giờ, số tế bào: 22.103/ g môi trường. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2:
Hình 3.2: Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hoạt độ enzyme protease
54
Kết quả ở đồ thị hình 3.2 cho thấy hoạt độ protease tăng dần độ ẩm từ 50 đến 60% và đạt cao nhất ở độ ẩm 60% (9,46 đv/g). Tuy nhiên nếu tăng độ ẩm tiếp lên 65%
thì hoạt độ enzyme lại giảm (7,67 đv/g). Điều này đƣợc lý giải do độ ẩm lớn làm môi trường bết, ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng và phát triển của nấm mốc làm hoạt độ enzyme giảm. Kết quả cho thấy nấm mốc A.oryzae sinh ra enzyme protease cao ở điều kiện môi trường có độ ẩm 60%. Vì vậy chúng tôi chọn độ ẩm môi trường là 60%
cho các nghiên cứu sau.
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Tiến hành nghiên cứu thay đổi nhiệt độ nuôi cấy lần lƣợt là: 25oC, 28oC, 30oC, 32oC với môi trường bã đậu bổ sung 5% bột mỳ, độ ẩm: 60%, thời gian nuôi: 48 giờ, số tế bào: 22.103/ g môi trường. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3:
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi nấm mốc đến hoạt độ enzyme protease Kết quả ở hình 3.3 cho thấy khi tăng nhiệt độ nuôi cấy từ 25 đến 30oC, hoạt độ enzyme protease tăng, nếu nhiệt độ tăng tiếp lên 32oC thì hoạt độ protease lại giảm, hoạt độ protease đạt cao nhất ở 30oC. Điều này cho thấy nấm mốc A.oryzae sinh
55
enzyme protease cao ở điều kiện nhiệt độ 30oC (9,52 đv/g). Vì vậy chúng tôi chọn nhiệt độ 30oC để nuôi cấy A.oryzae sinh enzyme protease.
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Tiến hành nghiên cứu thay đổi thời gian nuôi: 42 giờ, 48 giờ, 54 giờ, 60 giờ với môi trường bã đậu bổ sung 5% bột mỳ, độ ẩm: 60%, nhiệt độ nuôi: 30oC, số tế bào:
22.103/ g môi trường. Kết quả được thể hiện hình 3.4:
Hình 3.4: Ảnh hưởng thời gian nuôi nấm mốc đến hoạt độ protease
Kết quả ở hình 3.4 cho thấy ở thời gian nuôi cấy A.oryzae là 42 giờ hoạt độ protease chỉ đạt đƣợc 4,46 đv/g, kéo dài thời gian nuôi đến 48 giờ cho hoạt độ enzyme protease đạt 10,42 đv/g,khi kéo dài đến 54 giờ thì hoạt độ protease tạo ra là 10,19 đv/g và tiếp tục kéo dài đến 60 giờ thì hoạt độ protease chỉ còn 3,58 đv/g. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy là 48 giờ. Kết quả này cũng tương tự với kết quả của Chuenjit Chancharoonpong và cộng sự [14] khi nghiên cứu sự phát triển của A.oryzae và sản sinh enzyme trên môi trường bã đậu. Có thể thấy ở khoảng thời gian từ 42 đến 48 giờ,
56
hoạt độ enzyme tăng mạnh, trong khi đó hoạt độ enzyme không có sự khác biệt nhiều khi nuôi cấy trong khoảng thời gian từ 48 đến 54 giờ và bắt đầu giảm mạnh ở mốc 60 giờ. Nhƣ vậy có thể thấy enzyme protease có hoạt tính tốt nhất trong giai đoạn logarit (giai đoạn chỉ số) trên đường cong sinh trưởng của nấm A.oryzae trên môi trường bã đậu đƣợc nghiên cứu.
3.2.5. Nghiên cứu tỷ lệ nấm mốc giống được sử dụng
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu thay đổi tỷ lệ nấm mốc giống đƣợc sử dụng để nuôi cấy trong môi trường 25g bã đậu lần lượt là 0,5ml, 1ml, 1,5ml dịch chứa nấm mốc giống (tương đương số tế bào lần lượt là 0,275.106; 0,55.106,; 0,825.106) với điều kiện nuôi cấy là môi trường bã đậu bổ sung 5% bột mỳ, độ ẩm: 60%, nhiệt độ nuôi: 30oC, thời gian nuôi 48 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.5:
Hình 3.5: Ảnh hưởng của số tế bào nấm mốc đến hoạt độ protease
Đồ thị hình 3.5 cho thấy khi cho nấm mốc vào 25 gam môi trường với tỷ lệ tăng lần lƣợt từ 0,5 đến 1 ml thì hoạt độ enzyme protease tăng từ 9,34 đến 10,42 đv/g. Tuy
57
nhiên khi tăng lƣợng dịch chứa nấm mốc lên 1,5ml thì hoạt độ protease không tăng, thậm chí còn giảm xuống còn một ít còn 10,20 đv/g. Nhƣ vậy chúng tôi chọn tỷ lệ nấm mốc giống 1ml cho môi trường 25g với số tế bào nấm mốc trong 1 ml dịch được xác định là 550.000 tế bào hay có thể chuyển là 22.103 TB/g môi trường bã đậu (theo phương pháp đếm khuẩn lạc).
Tóm tắt: Đã xác định được điều kiện nuôi Aspergillus oryzae thích hợp để thu được hoạt độ enzyme protease cao (10,42 đv/g) là thành phần nguyên liệu: 5% bột mỳ và 95% bã đậu, độ ẩm môi trường: 60%, nhiệt độ nuôi cấy: 30oC, thời gian nuôi cấy:
48 giờ, số tế bào giống: 22.10 3 TB/g môi trrờng.