Sau khi nuôi cấy A.oryzae trên môi trường bã đậu thu được hoạt độ protease, chúng tôi tiếp tục ủ ẩm để sử dụng enzyme tạo ra sẽ thủy phân protein có trong bã đậu.
Để quá trình thủy phân diễn ra tốt, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân bã đậu bởi protease từ A.oryzae và chỉ tiêu để đánh giá kết quả của quá trình thủy phân là lƣợng protein hòa tan, acid amin tạo thành. Sau đó chúng tôi xác định lƣợng peptide và khả năng chống oxi hóa tạo thành của sản phẩm thủy phân ở điều kiện thích hợp thủy phân bã đậu bởi protease từ A.oryzae đã lựa chọn.
3.3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường thủy phân
Tiến hành nghiên cứu thay đổi độ ẩm của quá trình ủ ẩm: 60, 65, 70, 75% với điều kiện thủy phân là nhiệt độ 55oC, thời gian 56 giờ. Sau đó xác định lƣợng protein hòa tan, acid amin tạo thành, theo đó kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6:
58
Hình 3.6: Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein hoà tan và acid amin sau thuỷ phân
Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, khi tăng hàm ẩm của môi trường thủy phân lên từ 60% đến 65% thì lƣợng protein hòa tan tăng từ 12,01 đến 14,82% chất khô bã đậu, đồng thời lƣợng acid amin tăng từ 2,14 đến 2,9% chất khô bã đậu. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng độ ẩm đến 70% thì lƣợng protein hòa tan giảm còn 8,98% chất khô bã đậu, acid amin còn 1,54% chất khô bã đậu. Sau đó cho dù độ ẩm càng tăng thêm, các chỉ tiêu trên vẫn giảm. Điều này có thể cho rằng khi độ ẩm cao (70% và 75%), nhƣ vậy nồng độ enzyme trong môi trường bị giảm do pha loãng nên sản phẩm thủy phân giảm.
Nhƣ vậy ở độ ẩm 65% chúng tôi thu đƣợc kết quả thủy phân tốt nhất: Protein hòa tan 14,82% chất khô bã đậu, acid amin 2,9% chất khô bã đậu. Vì vậy chúng tôi chọn độ ẩm của quá trình ủ ẩm là 65% cho nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân
Tiến hành nghiên cứu nhiệt độ ủ ẩm thay đổi ở các khoảng 45, 50, 55, 60 oC với điều kiện độ ẩm 65%, thời gian ủ ẩm là 56 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.7:
59
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng protein hoà tan và acid amin sau thuỷ phân.
Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, khi tăng nhiệt độ từ 45 đến 55oC, lƣợng protein hòa tan tăng lên từ 7,48 đến 14,92% chất khô bã đậu, acid amin tăng từ 1,57 đến 2,98%
chất khô bã đậu. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nhiệt độ đến 60oC thì lƣợng protein hòa tan giảm còn 8% chất khô bã đậu, acid amin còn 2,05% chất khô bã đậu. Nhƣ vậy ở nhiệt độ 55oC, enzyme protease đã thủy phân môi trường bã đậu thu được kết quả tốt nhất: Protein hòa tan 14,92% chất khô bã đậu, acid amin 2,98% chất khô bã đậu. Điều này đƣợc giải thích là nhiệt độ 55oC là nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân của enzyme protease từ A.oryzae. Vì vậy chúng tôi chọn nhiệt độ của quá trình thủy phân là 55oC cho nghiên cứu tiếp theo.
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu thời gian ủ ẩm với các khoảng 48, 52, 56, 60 giờ với điều kiện thủy phân là độ ẩm 65%, nhiệt độ là 55 oC. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.8:
60
Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hoà tan và acid amin sau thuỷ phân
Kết quả ở hình 3.8 cho thấy khi tăng thời gian thủy phân từ 48 đến 56 giờ thì lƣợng protein hòa tan tăng lên từ 7,37 đến 14,91% chất khô bã đậu, acid amin tăng từ 1,3 đến 2,96% chất khô bã đậu. Các chỉ tiêu trên không có sự thay đổi mạnh khi ta tăng thời gian đến 60 giờ, cụ thể nhƣ lƣợng protein hòa tan giảm nhẹ còn 13,54% chất khô bã đậu, acid amin còn 2,92% chất khô bã đậu. Nhƣ vậy thủy phân ở 56 giờ là đủ cho quá trình thủy phân của enzyme protease từ A.oryzae. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian thủy phân là 56 giờ.
3.3.4. Xác định hàm lượng peptide và khả năng chống oxi hóa của mẫu ở điều kiện thủy phân đã chọn
Chúng tôi tiếp tục sử dụng các mẫu ở điều kiện thủy phân thích hợp cho hàm lƣợng protein hòa tan và acid amin cao nhất để tiến hành khảo sát hàm lƣợng peptide và khả năng chống oxi hóa. Kết quả thu đƣợc hàm lƣợng peptide: 0,18% chất khô bã đậu; hoạt tính chống oxi hóa là 36,03%.
61
Tóm tắt: Như vậy, chúng tôi đã xác định các điều kiện thủy phân bã đậu thích hợp bao gồm: Độ ẩm môi trường: 65%, nhiệt độ thủy phân: 55oC, thời gian thủy phân:
56 giờ để thu được sản phẩm thủy phân với hàm lượng peptide: 0,18% chất khô bã đậu; protein hoà tan: 14,92% chất khô bã đậu; acid amin: 2,98% chất khô bã đậu, hoạt tính chống oxi hóa là 36,03%.