CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phương pháp điện di mao quản với detectơ UV-VIS
3.1.1. Khảo sát hệ đệm điện di
Các thông số quan trọng của dung dịch đệm là pH, thành phần và nồng độ.
Chúng có ảnh hưởng khá lớn đến độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp. Vì vậy chúng tôi khảo sát để tối ưu các điều kiện đó.
3.1.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đệm
Trong phương pháp CE, sự điện di được thực hiện trong môi trường chất đệm pH và chất điện giải thích hợp. Nó có tác dụng duy trì dòng điện trong mao quản, dòng điện di thẩm thấu (EOF) và sự di chuyển của các chất phân tích [6]. So với các thuốc thử hữu cơ khác hằng số bền của phức của từng NTĐH với HIBA có sự khác biệt tương đối rõ ràng. Quá trình tách các NTĐH dựa trên cơ sở sự khác nhau về mức độ tạo phức của các nguyên tố này với α-HIBA trong dung dịch đệm điện di thích hợp. Vì vậy giá trị pH, nồng độ (dung lượng đệm), loại dung dịch đệm điện giải có vai trò rất quan trọng. Chúng ảnh hưởng trực tiếp đến độ sắc nét của pic và hiệu quả tách chất. Từ đó chúng tôi tiến hành khảo sát các giá trị pH từ 4,0 đến 5,3. Đây là khoảng pH mà các NTĐH tạo phức tối ưu nhất. Kết quả khảo sát được trình bày qua bảng 3.1, hình 3.1 và Phụ lục.
Bảng 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đệm
pH
Thành phần dung dịch đệm Benzylamin
(mM)
Axit axetic (mM)
α-HIBA (mM)
Các NTĐH (ppm)
4,0 9 11 6 5
4,3 9 10 6 5
4,6 9 9 6 5
4,9 9 8 6 5
5,3 9 6,5 6 5
53
Các điều kiện khác: detector UV; λ: 204nm; mao quản có L : 80cm, l : 65cm, id. 75àm; thế điện di: 20kV; phương phỏp bơm mẫu theo kiểu điện động học; nhiệt độ 25oC; chất tạo phức α-HIBA 6mM; dung dịch đệm điện di: benzylamin 11mM + axit axetic 10mM.
Ở pH = 4,6 thu được pic gọn, sắc nét, đồng thời độ phân giải giữa các nguyên tố tương đối tốt. Điều này có thể được giải thích như sau:
Trong dung dịch đệm điện di có các cân bằng sau:
HL = L- + H+ α1 (1)
M3+ + mL- = M(L)m3-m βm (2)
m = 1,2,3,4.
M3+ + OH- = M(OH)2+
(3) -Trong đó: M3+ là ion NTĐH; HL là tác nhân tạo phức HIBA
Độ điện di hiệu dụng của ion kim loại là:
àion =q/(6πηri) (4)
thời gian (phút) độ
hấp thụ quang
(A)
Hình 3.1. Kết quả phân tách các NTĐH ở pH = 4,6.
54
Tốc độ di chuyển của cỏc ion NTĐH được đặc trưng bằng độ điện di hiệu dụng àef được tính theo công thức:
àef = (àion + àEOF) (5)
àion: độ điện di của ion kim loại trong dung dịch điện ly.
àEOF: độ điện di của dũng điện thẩm thấu.
Độ điện di của ion kim loại được xem như là tổng độ điện di của các ion phức của kim loại với HIBA.
àion = χM3+àM3+ + χML2+ àML2+ + χML2+ à ML2++ χML3 à ML3 + χML4- à ML4- (6) Trong đú: χi tỷ lượng mol ; ài là độ điện di của cỏc ion kim loại.
Ảnh hưởng của pH đến sự tách các ion NTĐH biểu hiện tương tác giữa ion NTĐH và HIBA. Khi pH giảm cân bằng (1) chuyển dịch sang trái làm cho cân bằng (2) cũng bị ảnh hưởng kéo theo nồng độ của phức giảm. Ngược lại khi tăng pH tốc độ phân ly của HIBA tăng lên dẫn đến nồng độ của tác nhân tạo phức trong dung dịch điện ly tăng lên làm cho mức độ tạo phức của ion kim loại cũng tăng lên.
Ở một pH xác định, thời gian di chuyển của các ion NTĐH phụ thuộc vào khả năng tạo phức của chúng với HIBA. Trong khi đó hằng số bền tạo phức của các NTĐH với HIBA tăng dần từ La đến Lu, nghĩa là độ linh động điện ly của ion kim loại (àion ) giảm dần từ La đến Lu theo phương trỡnh (6) làm cho độ điện di hiệu dụng giảm theo. Điều này dẫn đến trên phổ sắc kí pic của La xuất hiện đầu tiên sau đó đến pic của các nguyên tố lần lượt theo thứ tự, cuối cùng là pic của Lu. Cũng trên phổ sắc kí pic của các nguyên tố đầu dãy như La, Ce, Pr và Nd thường gọn và sắc nét hơn so với các nguyên tố cuối dãy với chân pic rộng hơn. Điều này chứng tỏ trong quá trình chạy sắc kí các nguyên tố ở đầu dãy có khả năng tạo phức kém, kích thước ion phân tử phức nhỏ, điện tích dương lớn làm cho vùng mẫu tập trung hơn
55
nhiều so với các nguyên tố ở cuối dãy có khả năng tạo phức tốt hơn, kích thước ion phân tử phức lớn hơn, điện tích dương nhỏ hơn.
Ở pH = 4,9 ÷ 5,3 pic của phổ sắc ký ghi được không sắc nét, đường nền nhiễu so với pH = 4,6. Có thể lúc này hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện do sự tăng cường độ dòng khi nồng độ ion H+ trong dung dịch tăng. Khi pH lớn hơn 5 pic của các NTĐH bắt đầu rộng ra, có thể xảy ra phản ứng tạo hydroxit.
Ngoài ra, chúng ta có thể dựa vào giá trị ∆R (độ phân giải các pic giữa các NTĐH) để lựa chọn pH tối ưu cho hệ đệm này.
Bảng 3.2: Độ phân giải của các pic giữa các NTĐH ở các pH khác nhau
pH
∆R
4,0 4,3 4,6 4,9 5,3
La-Ce 4,35 3,60 5,56 1,67 1,20
Ce-Pr 3,45 2,78 1,53 1,14 1,05
Pr -Nd 2,43 2,00 3,88 1,31 0,73
Nd-Sm 5,38 3,61 3,33 3,93 2,17
Sm-Eu 2,00 1,89 2,00 2,07 0,50
Eu-Gd 0,86 1,03 1,48 1,28 0,54
Gd-Tb 3,17 3,51 3,24 4,17 1,57
Tb-Dy 2,56 2,45 2,20 3,56 1,15
56
Dy-Ho 2,18 1,57 1,63 2,17 0,92
Ho-Er 2,52 2,50 1,73 2,50 1,15
Er-Yb 4,83 4,29 2,95 5,93 2,69
Yb-Lu 1,71 1,74 1,51 2,59 1,24
Dựa vào bảng 3.2 cùng các sắc đồ pic, chúng ta dễ dàng nhận ra cặp Eu và Gd được tách tốt nhất ở pH = 4,6. Từ nhiều thực nghiệm cho thấy đây là hai nguyên tố rất khó tách, pic của chúng thường chồng lên nhau hoặc không tách rời chân.
Hơn nữa, khi pH dung dịch từ 4,5 ÷ 4,6 thì phổ sắc ký thu được sắc nét, độ phân giải cao, đường nền tương đối phẳng. Ở pH này khả năng tạo phức của các ion NTĐH với α-HIBA vừa đủ để tạo ra sự khác biệt về độ điện di của chúng và không làm thay đổi dòng điện thẩm thấu của dung dịch điện ly.
Do đó điều kiện tối ưu cho việc tách các NTĐH là dung dịch đệm có pH = 4,6.
3.1.1.2. Khảo sát nồng độ tối ƣu của các chất điện ly trong dung dịch đệm Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly mạnh) trong pha động có vai trò quan trọng và phải có nồng độ thích hợp. Trong thực tế người ta cố gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời là chất điện giải của sắc kí điện di. Do đó để pha động không có thành phần phức tạp và ít ảnh hưởng đến quá trình tách sắc kí chúng tôi chọn hỗn hợp benzylamin và axit axetic đóng hai vai trò: vừa là chất đệm pH, vừa là chất điện giải cho quá trình điện di các NTĐH. Sau khi pha 3 mẫu dung dịch, bằng việc dùng axit axetic để điều chỉnh pH = 4,6 chúng tôi tiến hành chạy sắc ký và thu được các kết quả ở bảng 3.3 và hình 3.2 cùng với Phụ lục.
57
Hình 3.2. Sắc đồ tách 13 các NTĐH ở pH = 4,6 và thành phần như dung dịch 2.
Bảng 3.3: Nồng độ dung dịch chất điện ly ở pH = 4,6
Số dung dịch Nồng độ dung dịch đệm
Benzylamin (mM)
Axit axetic (mM)
α-HIBA (mM)
Các NTĐH (ppm)
Dung dịch 1 7,3 3,5 6 5
Dung dịch 2 11 10 6 5
Dung dịch 3 13 14 6 5
Thực nghiệm cho thấy khi tăng nồng độ của thành phần đệm thì thời gian di chuyển của các ion tăng lên, nhưng sự tăng là không lớn. Điều này cho thấy: Trong ống mao quản khi nồng độ chất điện giải tăng tức là nồng độ các ion tăng, các ion này sẽ làm giảm độ lớn của lớp điện kép, vì lớp điện kép và thế Zêta phụ thuộc vào lực ion của dung dịch đệm điện di. Yếu tố liên quan đến sự hình thành, độ lớn và sự tồn tại của lớp điện kép trong mao quản. Khi lực ion của dung dịch đệm điện di tăng thì lớp điện kép bị hẹp lại. Do đó làm thế Zêta giảm, tức là ảnh hưởng đến dòng điện di thẩm thấu. Điều này thể hiện qua công thức.
VEOF = E.(ε.ζ/η) (7)
độ hấp thụ quang
(A)
thời gian (phút)
58 Trong đó:
ζ = (4Π.rd.q)/ε.
ζ -Thế zêta
rd- Bán kính hydrat của ion.
rd = (ε.K.T)/8.Π.e2.I
Công thức tính rd cho thấy: Khi nồng độ đệm lớn tức là giá trị lực ion I lớn thì rd giảm, nghĩa là thế Zêta giảm theo công thức tính ε. Khi đó tốc độ của dòng EOF giảm, làm cho tốc độ di chuyển của các ion NTĐH giảm theo. Nhưng sự giảm này là không đáng kể khi nhìn vào công thức tính rd.
Đối với đệm dung dịch 1: thời gian di chuyển của các ion đất hiếm tương đối dài, pic của phổ ghi được rộng chân.
Đệm dung dịch 3: thời gian di chuyển của các ion các NTĐH nhanh làm độ phân giải không cao. Điều này có thể do khi nồng độ đệm cao gây ra hiệu ứng nhiệt Jun vì dòng ampe tăng lên.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của dung dịch đệm 2
Đệm dung dịch 2 được chọn vì phổ sắc ký sắc nét, đường nền phẳng và có độ phân giải cao.
độ hấp thụ quang
(A)
thời gian (phút)
59 3.1.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ α-HIBA
Trong quá trình chạy sắc ký điện di, pha động là yếu tố hết sức quan trọng, nó quyết định đến kết quả tách pic. Hình dạng pic của 13 các NTĐH phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ của axit α-HIBA mà chúng tạo phức. Kết quả khảo sát sự thay đổi nồng dộ của axit α-HIBA được thể hiện ở bảng 3.4. Trong đó pH được giữ cố định bằng 4,6 và nồng độ α-HIBA thay đổi: 4mM; 6mM và 8mM.
Bảng 3.4: Khảo sát nồng độ α-HIBA
Số thí nghiệm
Thành phần dung dịch đệm Benzylamin
(mM)
Axit axetic (mM)
α-HIBA (mM)
Các NTĐH (ppm)
Dung dịch 1 10 10 4 5
Dung dịch 2 11 10 6 5
Dung dịch 3 12 10 8 5
Khi tăng nồng độ α-HIBA thời gian di chuyển của các NTĐH tăng dần. Ở một nồng độ α-HIBA, t(phút) tăng dần từ La đến Lu. Ở nồng độ α-HIBA 6mM và 8mM cho phổ sắc ký sắc nét, cân đối và độ phân giải cao hơn so với nồng độ α- HIBA 4mM.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của α-HIBA 6mM độ
hấp thụ quang
(A)
thời gian (phút)
60
Việc tăng nồng độ α-HIBA dẫn đến phản ứng:
mHIBA- + Ln3+ ↔ Ln[HIBA]m3-m (2) chuyển mạnh sang phải làm cho mức độ tạo phức của ion kim loại với α-HIBA tăng lên. Sự tạo phức mạnh làm giảm điện tích chung của ion kim loại, dẫn đến thời gian di chuyển của ion các NTĐH chậm đi.
Ở nồng độ 4mM độ phân giải giữa Eu và Gd không được tốt, pic phổ ghi được có chân tương đối rộng. Có thể ở điều kiện này nồng độ α-HIBA chưa đủ để các ion NTĐH tạo phức hoàn toàn.
Tổng kết lại chúng tôi chọn các điều kiện tối ưu của dung dịch đệm điện di như trong bảng 3.5
Bảng 3.5: Các điều kiên tối ưu của dung dịch đệm điện di Thành phần dung dịch đệm
Benzylamin (mM)
Axit axetic (mM)
α-HIBA (mM)
pH
11 10 6 4,6
Từ những kết quả thực nghiệm ở trên, phương pháp sắc ký điện di mao quản rất thuận tiện để tách và xác định đồng thời 13 NTĐH. Ở pH = 4,6 ta có α- HIBA 6mM là một tác nhân tạo phức tốt cho quá trình tách và xác định đồng thời 13 NTĐH. Việc sử dụng chất hấp thụ quang benzylamin ở vùng UV với bước sóng 204nm kết hợp kiểu bơm mẫu điện động học (10 giây, 5kV) và mao quản có kích thước 75àm i.d (chiều dài tổng và hiệu dụng tương ứng 80 cm và 65 cm) đó cho phép tách và xác định đồng thời 13 NTĐH trong cùng hỗn hợp. Đây là phép phân tích khá đơn giản và dễ thao tác, phù hợp cho mẫu thực tế.