CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN
3.2. Phương pháp điện di mao quản với detectơ độ dẫn không tiếp xúc
3.2.1. Khảo sát điều kiện tách các NTĐH bằng phương pháp điện di
Việc khảo sát một số điều kiện tách các NTĐH được thực hiện bởi thiết bị điện di CE- C4D bán tự động, sử dụng mao quản có chiều dài 60 cm, đường kính trong 50àm. Bơm mẫu bằng phương phỏp thủy động lực học theo kiểu xiphụng (nâng một đầu mao quản lên 10cm so với đầu mao quản còn lại và giữ nguyên độ cao này trong tất cả các thí nghiệm)
74
3.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm điện di
Sử dụng hỗn hợp mẫu chuẩn trong toàn bộ khảo sát này, với nồng độ của La:
26,0ppm, Ce: 42,0ppm, Pr : 24,0ppm, Nd: 13,0ppm, Sm: 11,0ppm, Eu: 1,60ppm, Gd :100ppm, Tb: 10,0ppm, Dy: 2,10ppm;Ho: 18,4ppm, Er :12,9ppm, Tm :6,80ppm, Yb :10,0ppm, Lu : 1,90ppm.
a. Khảo sát pH của dung dịch đệm điện di
Theo tài liệu [74] cho thấy các NTĐH tách khỏi nhau khá tốt trong khoảng pH từ 3,6 đến 4,6. Do đó, chúng tôi khảo sát những giá trị pH từ 3,6 đến 4,6. Các điều kiện khác cụ thể như sau:
- Các giá trị pH khảo sát là: 3,6; 3,8; 4,0; 4,2; 4,4 và 4,6.
- Thế điện di 15kV, thời gian bơm mẫu 10s.
Chúng tôi đo 3 hệ đệm khác nhau ở 5 giá trị pH. Đó là: hệ Arg/Asc, hệ Arg/Ace và hệ His/Ace. Kết quả thu được ở hình 3.23
Hình 3.23. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với các hệ đệm tín hiệu C4 D
thời gian (s)
75
Các điều kiện khác: detector C4D;; mao quản có L : 60cm, l : 53cm, id.
50àm; thế điện di: 15kV; phương phỏp bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học kiểu xiphong; nhiệt độ 25oC; chất tạo phức α-HIBA 10mM; dung dịch đệm điện di:
Arg/Ace 20mM.
Trong phương pháp điện di mao quản, khi pH của dung dịch đệm thay đổi sẽ làm thay đổi điện tích, tốc độ của các chất, từ đó làm thay đổi thời gian di chuyển của các chất phân tích trong mao quản. Trong 3 hệ đệm thì 14 NTĐH được tách toàn bộ ở hệ Arg/Ace. Riêng hai hệ Arg/Asc và hệ His/Ace thì chỉ tách hoàn toàn tối đa là 8 nguyên tố.
Đối với hệ Arg/Ace, qua các kết quả khảo sát pH cho thấy: các giá trị pH nhỏ hơn 4,2 và lớn hơn 4,4 đều không cho kết quả tách tốt đối với cặp nguyên tố Eu và Gd. Giữa hai giá trị pH 4,2 và 4,4 chúng tôi chọn giá trị 4,2 bởi vì đường nền ổn định, chân pic gọn, sắc nét. Hơn nữa độ phân giải của các NTĐH đều lớn hơn 1,5.
Mặc dù cặp Eu-Gd có ∆R = 1,09 nhưng trên thực tế vẫn đảm bảo cho việc định lượng theo diện tích pic một cách chính xác. Kết quả thể hiện ở bảng 3.10 và 3.11.
Bảng 3.10: Độ phân giải giữa các NTĐH ở các pH khác nhau với hệ đệm Arg/Ace pH
∆R 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6
La-Ce 1,44 1,92 1,69 2,44 1,10 3,00
Ce-Pr 1,42 1,70 1,33 2,13 1,56 2,60
Pr -Nd 1,40 1,33 1,29 1,57 1,33 1,23
Nd-Sm 3,63 2,80 - 3,11 3,57 3,33
Sm-Eu 1,63 1,68 - 1,86 2,16 -
Eu-Gd - - - 1,09 0,92 -
Gd-Tb - - 1,91 2,70 2,70 2,38
Tb-Dy 1,47 2,00 1,69 1,77 1,54 1,36
Dy-Ho 1,47 1,57 1,20 1,52 1,25 0,94
76
Ho-Er 1,53 2,25 1,56 1,52 1,79 1,45
Er-Tm 1,67 2,00 1,86 1,54 2,00 1,80
Tm-Yb 1,29 1,59 1,66 1,57 1,86 1,20
Yb-Lu - 1,55 1,53 1,56 1,39 1,21
Chú thích: – nghĩa là không xuất hiện pic.
Bảng 3.11: Diện tích pic các NTĐH đối với hệ đệm Arg/Ace pH
Nguyên tố
3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6
La 43,37 29,34 27,68 27,51 28,25 15,36
Ce 36,09 26,20 31,19 19,50 22,59 11,75
Pr 17,31 13,55 14,53 8,03 13,28 1,85
Nd 20,08 16,76 17,84 11,76 10,14 2,85
Sm 11,88 8,23 - 5,73 7,97 2,27
Eu 9,98 6,26 - 3,35 - -
Gd - - 15,34 10,08 - 9,98
Tb 15,43 12,26 32,14 15,64 15,11 21,1
Dy 15,50 20,64 34,72 33,12 42,23 34,36
Ho 24,73 29,10 54,43 48,61 60,04 48,52
Er 13,36 22,32 43,69 31,24 36,43 29,28
Tm 26,72 20,13 18,84 23,28 21,28 15,64
Yb 26,22 34,73 40,13 42,62 34,50 32,08
Lu - 30,97 35,58 33,75 26,73 13,53
Từ các kết quả trên chúng tôi chọn pH = 4,2 cho các bước khảo sát tiếp theo.
77
b. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm điện di
Trong phương pháp điện di mao quản, nồng độ đệm phải đủ lớn để tạo nên môi trường điện ly cho các ion di chuyển và không tạo ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao quản làm ảnh hưởng đến quá trình di chuyển này. Thông thường nồng độ của các cấu tử trong dung dịch đệm điện di sử dụng trong phương pháp CE-C4D thường lớn hơn 10 mM. Do đó, việc khảo sát được tiến hành với các nồng độ từ 10mM trở lên, cụ thể là hệ đệm Arg/Ace với pH = 4,2, có các nồng độ Arg 10 mM, 20 mM, 30 mM. Các điều kiện khác bao gồm:
- Thế điện di 15kV, thời gian bơm mẫu 10s.
Hình 3.24. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di.
Nhận xét: Khi tăng nồng độ dung dịch đệm điện di thì thời gian di chuyển của các NTĐH đều tăng nhưng tín hiệu (diện tích) pic lại giảm. Bởi vì khi tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của các ion dương và ion âm tăng, do đó làm tăng thời gian di chuyển của chất tan. Khi nồng độ đệm tăng cũng làm tăng độ dẫn điện của dung dịch điện ly nền từ đó làm giảm tín hiệu của các chất phân tích.
Ngoài ra, trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ của các ion tăng, thường làm thay đổi độ lớn của lớp điện kép, ảnh hưởng đến sự tương
800 700
600 500
400 300
200
10mM
20mM 30mM
La Ce Pr Nd
SmEu Gd
Lu Tm Yb
Dy Ho Er Tb
10mV
tín hiệu C4 D
thời gian (s)
78
tác tĩnh điện của lớp điện kép với thành mao quản. Lớp điện kép này thường làm cho vùng mẫu di chuyển không phẳng và khả năng tách chất kém, như với nồng độ đệm là 30mM. Nồng độ đệm 20mM cho thấy hình dáng các pic khá cân đối và sắc nét, các nguyên tố được tách tương đối tốt. Do đó, chúng tôi lựa chọn đệm Arg/Ace 20mM là điều kiện tối ưu cho các khảo sát tiếp theo.
c. Ảnh hưởng của nồng độ α-HIBA
Từ hình 3.27 chúng ta thấy sự có mặt α-HIBA dẫn đến các nguyên tố La và Ce cũng như Pr và Nd được tách tốt hơn. Các chân pic không dính nhau, đường nền phẳng. Như vậy có thể khẳng định ưu điểm của phương pháp đo khi có mặt α- HIBA. Do đó việc khảo sát nồng độ tối ưu của nó là thật sự cần thiết trong trường hợp tách 14 NTĐH. Kết quả của khảo sát thể hiện trên hình 3.25 với các mức nồng độ 5mM; 10mM và 20mM.
Hình 3.25. Khảo sát ảnh hưởng của α-HIBA.
Ở nồng độ 5mM phản ứng tạo phức chưa xảy ra hoàn toàn làm cho sự chênh lệch độ linh động điện di chưa đủ lớn nên độ phân giải không cao và chân pic tương đối rộng. Hơn nữa ở giá trị nồng độ này pic của cặp nguyên tố Eu và Gd hầu như không xuất hiện. Còn ở 20mM thời gian tách quá lớn, các pic xuất hiện không đồng đều, đường nền dâng. Điều này có thể do sự tạo phức mạnh làm tăng điện tích của
1000 800
600 400
200
5mM
10mM 20mM
20 mV
La
Sm Yb
DyHo Er Tb Nd
Migration time (s)
Eu Pr Ce
Tm Lu Gd
0mM
thời gian (s) tín hiệu C4 D
79
ion kim loại, dẫn đến sự thay đổi về độ linh động điện di. Kết quả là thời gian lưu quá lớn, đặc biệt đối với các nguyên tố nằm cuối dãy. Chân pic doãng rộng, độ phân giải kém. Riêng nồng độ 10mM ta có pic cân đối rõ nét, không có sự chèn lấn, thời gian phân tích hợp lí, tách được đầy đủ 14 nguyên tố. Do đó chúng tôi chọn nồng độ tối ưu của α-HIBA là 10 mM.
3.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu
Hình 3.26. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu.
Việc khảo sát thời gian bơm mẫu được thực hiện theo phương pháp thủy động lực học kiểu xiphông ở độ cao 10cm với 3 giá trị thời gian khác nhau: 5s, 10s và 15s . Các điều kiện khảo sát khác là: dung dịch đệm điện di: Arg/Ace (20 mM) với pH = 4,2 và thế 15kV.
Từ kết quả khảo sát ở hình 3.26 có thể nhận thấy: khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian lưu của các chất hầu như không thay đổi hoặc thay đổi rất ít nhưng diện tích pic tăng. Điều này hoàn toàn phù hợp vì khi tăng thời gian bơm mẫu sẽ làm tăng lượng mẫu được bơm vào mao quản, tạo tín hiệu lớn hơn. Tuy nhiên, khi đó cũng làm dịch chuyển đôi chút về thời gian lưu của các chất cũng như làm giảm độ phân giải giữa các pic. Cụ thể ở 5s các nguyên tố tách nhau tương đối tốt nhưng diện tích pic lại hơi nhỏ điều này làm ảnh hưởng đến giới hạn phát hiện của phương pháp. Còn ở 15s thì diện tích pic lại lớn nhất nhưng độ phân giải của cặp Eu-Gd lại
1200 1000
800 600
400 200
5 s
10 s
15 s
Migration time (s) 10 mV
La Ce Pr Nd
SmEu
Gd Yb
Tb Dy Er Lu
Ho
Tm
thời gian (s) tín hiệu C4 D
80
giảm ảnh hưởng đến sự phát hiện trong mẫu. Do đó, chúng tôi lựa chọn thời gian bơm mẫu 10s là điều kiện tối ưu trong nghiên cứu này.
3.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thế đặt vào hai đầu mao quản
Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế (E) một chiều nhất định đặt vào hai đầu mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Trên cơ sở trang thiết bị sẵn có, các điện thế được chúng tôi lựa chọn khảo sát là: 10 kV, 15 kV, 20kV và 25kV. Các điều kiện khác áp dụng các kết quả tối ưu ở trên bao gồm:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn với nồng độ của La: 26,0ppm, Ce: 42,0ppm, Pr : 24,0ppm, Nd: 13,0ppm, Sm: 11,0ppm, Eu: 1,60ppm, Gd :100ppm, Tb: 10,0ppm, Dy: 2,10ppm;Ho: 18,4ppm, Er :12,9ppm, Tm :6,80ppm, Yb :10,0ppm, Lu : 1,90ppm.
- Dung dịch đệm điện di là Arg/Ace (20mM), pH =4,2
- Bơm mẫu bằng phương pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông trong 10s.
Hình 3.27. Khảo sát ảnh hưởng của thế đặt vào hai đầu mao quản.
1500 1000
500 0
10 kV
15 kV
20 kV
25 kV 20 mV
La Ce
Sm
Tb Dy Ho Er Tm Lu
Migration time (s)
Eu Gd Pr Nd
Yb
tín hiệu C4 D
thời gian (s)
81
Khi áp thế từ 10 kV đến 25 kV, thời gian lưu của các chất giảm. Tại thế 10kV các chất tách nhau tốt nhưng thời gian lưu của các chất khá lớn. Tại thế tách 10kV sau hơn 10 phút pic của La mới xuất hiện. Với thế 20kV và 25 kV thời gian di chuyển của các chất ngắn hơn, cụ thể chỉ hơn 4 phút pic của La đã xuất hiện nhưng độ phân giải giữa các pic kém, đồng thời cặp Eu và Gd không tách được. Lí do khi tăng thế E, dòng điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm nóng mao quản, làm giảm hiệu quả tách. Thế tách 15kV đạt hiệu quả tách tốt, thời gian phân tích phù hợp. Vì vậy chúng tôi lựa chọn thế 15kV là thế tối ưu.
Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp các NTĐH được tổng hợp trong bảng 3.12 và được thể hiện trên hình 3.28.
Bảng 3.12: Điều kiện tối ưu khi phân tích hỗn hợp các NTĐH
Các yếu tố Điều kiện
Detectơ (hệ CE) CE-C4D
Mao quản Silica, chiều dài tổng 60 cm, chiều dài hiệu dụng 53cm, đường kớnh trong 50àm
Phương pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xiphông: H=10cm Thời gian bơm mẫu 10s
Dung dịch đệm điện di Arg/Ace (20mM), pH=4,2
Thế tách 15kV
82
Hình 3.28. Biểu diễn các điều kiện tách tối ưu 14 NTĐH.