1.5.1. Ứng dụng nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô ra đời và có nhiều ứng dụng khác nhau như vi nhân giống, tạo cây đơn bội, chọn dòng tế bào thực vật (chọn dòng chịu bệnh, chọn dòng chịu stress, nuôi cấy protoplast khắc phục hiện tượng lai xa, chuyển gen thực vật,…) đặc biệt ứng dụng nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn cũng như chọn dòng có năng
17
suất về hợp chất thứ cấp đang được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sinh khối thực vật (sinh khối là dạng vật liệu sinh học từ sự sống, hay gần đây là sinh vật sống, đa số là các cây trồng hay vật liệu có nguồn gốc từ thực vật).
Sinh khối có thể sử dụng trực tiếp và cũng có thể sử dùng một cách gián tiếp.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật chỉ sau 1 thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng sinh khối lớn có hoạt chất cao, thực vật nuôi cấy in vitro vẫn có thể tạo ra sinh khối có hoạt chất cao, nghĩa là thực vật nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp như alkaloid, glycosid, các steroid dùng trong y học,…
1.5.2. Định nghĩa
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu từ thực vật hoàn toàn sạch các loại vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Nguyễn Văn Đồng và Ngô Xuân Bình, 2010).
Ưu điểm:
- Phương pháp nuôi cấy mô có thể tạo ra một số lượng lớn cây từ một cây mẹ ban đầu (hệ số nhân của các loại cây trong khoảng 36 đến 1012), với cơ quan của cây có thể là 0,1 – 1 mm. Trong khi đó, đối với những phương pháp truyền thống thì để tạo ra số lượng cây tương đương thì cần có nhiều cây mẹ hơn và thời gian cũng lâu hơn, kích thước ban đầu có thể là từ 10 – 25 cm.
- Thao tác hoàn toàn trong điều kiện vô trùng, cây con sẽ tránh được các tác nhân bất lợi từ môi trường bên ngoài.
- Sử dụng vật liệu ban đầu sạch virus có thể tạo ra được rất nhiều cây sạch virus.
- Cây nếu như không cần sử dụng ngay có thể bảo quản với số lượng lớn trong một thời gian dài.
- Các tế bào thực vật có thể được cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lí. Không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô.
18
- Có thể kiểm soát được chất lượng và hiệu suất của sản phầm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật như là chất lượng nguyên liệu thô và đồng nhất giữa các lô sản xuất.
- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào có chất lượng cao hơn so với trong cây hoàn chỉnh (Ngô Xuân Bình, 2010).
Hạn chế:
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp.
- Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như thiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình, cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền (Ngô Xuân Bình, 2010).
1.5.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của thực vật in vitro
1.5.3.1. Nuôi cấy trên môi trường rắn
Độ cứng của môi trường có ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy in vitro. Có một số chất có tác dụng làm đông đặc môi trường như agar, agarose, gellan gum. Trong đó agar được sử dụng khá rộng rãi. Agar là một loại polysacharide được thu nhận từ rong biển và được biết đến như là một chất làm đông đặc môi trường trong nuôi cấy mô in vitro. Agar hòa tan trong nước ở nhiệt độ từ 60 – 100oC và đông đặc ở khoảng nhiệt độ 45oC. Agar không phản ứng với các
19
thành phần môi trường cũng như không bị triệt tiêu bởi các hoocmon thực vật và được sử dụng trong khoảng 0,8 – 1%. Ưu điểm của agar khi bổ sung vào môi trường là hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, môi trường chứa agar cũng có một số mặt bất lợi như môi trường bán rắn sẽ hạn chế sự di chuyển của các thành phần dinh dưỡng, do đó mẫu cấy chỉ hấp thụ được một phần dinh dưỡng ở vị trí gần nó. Khi cây sử dụng hết chất dinh dưỡng xung quanh, cây khó có thể hấp thu phần dinh dưỡng phân bố ở những vị trí xa mẫu, do vậy khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu bị giảm sút. Ngoài ra, các độc tố do mô thực vật tiết ra (thường gặp là hiện tượng cây tiết ra phenol) sẽ tập trung quanh nó gây ảnh hưởng đến sự phát triển của chính mẫu cấy. Môi trường bán rắn chỉ được sử dụng một lần, vì không thể thay đổi thành phần của môi trường để phù hợp với từng thời kỳ phát triển của thực vật vì vậy phải cấy chuyền liên tục.
1.5.3.2. Nuôi cấy lỏng
Hệ thống nuôi cấy lỏng ra đời đã đem lại nhiều triển vọng cho nuôi cấy mô.
Trong nuôi cấy lỏng có ba loại: hệ thống nuôi cấy lỏng tĩnh, hệ thống nuôi cấy lỏng lắc và hệ thông nuôi cấy bioreactor.
Nuôi cấy lỏng tĩnh: các tế bào được ngập chìm và để tĩnh trong môi trường nuôi cấy, sau thời gian nuôi cấy nhất định thì các tế bào được chuyển qua môi trường khác để có thể đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Ưu điểm của phương pháp này là việc chuẩn bị và sử dụng môi trường khá dễ dàng (Shakti và cộng sự, 2007). Nuôi cấy trong môi trường lỏng cho phép kiểm soát một cách chủ động các thông số lý hóa, là tiền đề cho xây dựng hệ thống tự động, triển khai trong quy mô công nghiệp. Chi phí sản xuất thấp hơn so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn, tiết kiệm được thời gian và lao động. Do không cần sử dụng chất làm đặc môi trường như agar vì thế sẽ giảm thiểu được nguồn chi phí cũng như nguồn nhân lực trong quá trình sản xuất. Do là môi trường lỏng nên các chất dinh dưỡng sẽ phân bố đều môi trường giúp cây tiếp xúc hoàn toàn với nguồn dinh dưỡng vì thế giảm thời gian nuôi cấy đi đáng kể. Tuy nhiên, trong môi trường lỏng tĩnh sự trao đổi không khí rất hạn chế, điều này sẽ làm cho mẫu cấy chậm phát triển,
20
đôi khi chết (đối với mẫu mô sẹo, protocorm,…). Mẫu cấy trong môi trường lỏng một thời gian sẽ xảy ra hiện tượng thủy tinh thể (Shakti và cộng sự, 2007).
Hình 1. 3: Quy trình nuôi cấy sinh khối cây lan gấm bằng kỹ thuật bioreactor. a:
mẫu cấy ban đầu. b, b1: mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. c, c1: khối lượng sinh khối thu nhận.
Nuôi cấy lỏng lắc: các tế bào được ngập chìm trong môi trường và sự thông khí nhờ máy lắc với tốc độ 100 – 150 vòng/phút. Nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc có những ưu điểm sau: các chất dinh dưỡng được khuếch tán trong môi trường với độ đồng đều cao tạo điều kiện cho mẫu hấp thu triệt để. Hơn nữa, toàn bộ bề mặt cây tiếp xúc với môi trường sẽ làm tăng hiệu quả hấp thu dinh dưỡng giúp cây sinh trưởng tốt hơn, giảm thời gian nuôi cấy. Do trong môi trường được lắc liên tục nên không có sự hạn chế về trao đổi khí nên cây phát triển tốt hơn môi trường lỏng tĩnh. Nuôi cấy lỏng lắc dễ dàng cho nhân giống với số lượng lớn cũng như tạo ra nhiều sinh khối. Nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo được nhiều chồi hơn. Ngoài ra, nuôi cấy lỏng lắc còn khắc phụ được hiện tượng thủy tinh thể trên môi trường lỏng tĩnh. Hạn chế của phương pháp này là trong quá trình lắc liên tục trong một thời gian có thể tạo ra các bọt khí nhỏ gây giảm nồng độ oxy hòa tan
21
trong môi trường, ngoài ra nuôi cấy lỏng (hoặc lỏng lắc) trong khoảng thời gian sẽ khiến môi trường bay hơi (Shakti và cộng sự, 2007). Vì thế, cần bổ sung hoặc cấy chuyển mẫu cấy sang môi trường khác để đảm bảo sự phát triển của mẫu cấy.