CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.3.1 Phân lập nấm Mycorrhiza sp1, Mycorrhiza sp2 từ chế phẩm để xác định hình dạng bào tử nấm cộng sinh [4], [5]
- Phương pháp phân lập nấm cộng sinh bằng kỹ thuật sàn ướt để xác định bào tử nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2
- Cân lần lượt 10g mẫu vào cốc, hòa tan mẫu vào 200ml nước, ngâm khoảng 30-60 phút, để giải phóng các bào tử trong chế phẩm. Sau đó, cho mẫu vào erlen và thêm 300 ml nước cất vào và lắc đều trong 1h để giải phóng hoàn toàn các bào tử trong mẫu.
- Quan sát bào tử nấm dưới kính hiển vi
- Xác định hình dạng bào tử nấm theo Morton (1988) 2.3.3.2 Phương pháp nhân sinh khối nấm Mycorrhiza sp [7]
- Hạt giống ngô (cây ngắn ngày, dễ trồng, dễ quan sát)
- Ngâm vào dung dịch có chứa bào tử nấm đã đƣợc phân lập (ngâm khoảng 24h)
- Cho hạt giống vào túi nilon có lớp giấy ẩm để kích thích để hạt nảy mầm - Chuẩn bị 2kg đất cho vào chậu (đất sạch Saigon biotech)
- Sau đó chuyển ngô đã kích thích tạo rễ ở trên vào chậu, rồi chăm sóc, tưới cây đều đặn. Thu phần rễ cây sau 3- 4 tuần
21
2.3.3.3 Phương pháp nhuộm rễ xác định dạng xâm nhiễm (Vierheilig et al.
1998, 2005) [6]
- Thu nhận rễ cây kí chủ đã nhiễm nấm (20 -30 ngày).
- Cắt rễ thành các đoạn nhỏ 2-4cm.
- Rửa sạch các đoạn rễ bằng nước.
- Cho rễ vào dung dịch KOH 10%
- Đem hỗn hợp dung dịch KOH và rễ đi hấp ở nhiệt độ 121oC trong vòng 15 phút.
- Rửa sạch KOH 10% bằng nước cất.
- Đặt rễ lên lame rồi cho hỗn hợp thuốc nhuộm Inkblue 5% với acid acetic 5% và quan sát dưới kính hiển vi.
2.3.3.4 Phương pháp nghiên cứu vai trò ảnh hưởng của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 đến sinh trưởng, phát triển của cây ngô
Cây kí chủ đƣợc lựa chọn dùng trong thí nghiệm này là cây ngô đƣợc cung cấp từ cục trồng trọt.
Bố trí thí nghiệm - CT1: Ngô + tưới nước
- CT2: Ngô + tưới nấm Mycorrhiza sp1 - CT3: Ngô + tưới nấm Mycorrhiza sp2
Phương pháp tiến hành
- Hạt được ngâm qua đêm trong nước ấm khoảng 40oC với (3 sôi: 2 lạnh) và đem giao vào đất ở độ sâu 2m.
- Số cây theo dõi là 6 cây/ công thức. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
- Sau khi cây mọc 5 ngày, tiến hành tưới 1 lần nấm Mycorrhiza vào đất với nồng độ 109 bào tử / cây, và tưới vào gốc cây.
Chỉ tiêu theo dõi - Kích thước cây - Khối lƣợng rễ - Chiều dài rễ
22
- Đường kính vùng rễ
2.3.3.5 Phương pháp đánh giá hiệu quả của 2 chế phẩm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 sau khi đã tái nhiễm
Cây kí chủ đƣợc lựa chọn dung trong thí nghiệm này là cây ngô đƣợc cung cấp từ cục trồng trọt.
Bố trí thí nghiệm - CT1:ngô + đất sạch
- CT2: ngô + nấm M1 trước nhiễm - CT3: ngô + M1 sau nhiễm trong rễ ngô - CT4: ngô + nấm M2 trước nhiễm - CT5: ngô + M2 sau nhiễm trong rễ ngô
Phương pháp thí nghiệm
- Rễ cây ngô sau khi nhiễm nấm M1 và M2 đƣợc thu nhận, phơi khô ở nhiệt độ phòng, cắt nhỏ, đếm mật độ bào tử và cho vào đất.
- Ngâm hạt bằng nước ấm khoảng 40oC ( 3 sôi: 2 lạnh) qua đêm sau đó đem gieo vào chậu ở độ sâu 5cm.
- Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong chậu nhựa (20 x 25cm), bổ sung 2kg đất khô vào từng chậu, mỗi công thức gồm 2 chậu, số cây theo dõi 4 cây/
chậu . Số bào tử nấm Mycorrhiza nhiễm cho 1 chậu là 3g/ chậu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Mỗi ngày tưới nước 2 lần sáng, chiều. Số bào tử nấm Mycorrhiza nhiễm vào là 109 bào tử/ 1 chậu.
Chỉ tiêu theo dõi - Chiều cao cây
- Khối lƣợng thân - Chiều dài rễ - Khối lƣợng rễ
23
2.3.3.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các mức phân P2O5 đến khả năng cộng sinh của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 thông qua sự phát triển và sinh trưởng của cây ngô
Cây kí chủ đƣợc lựa chọn dung trong thí nghiệm này là cây ngô đƣợc cung cấp từ cục trồng trọt.
Bố trí thí nghiệm
Đối với chủng nấm Mycorrhiza sp1
- CT1: Ngô + P205 mức 0.03 % (đất có chứa P2O5 với mức 0.03%) - CT2: Ngô + Mycorrhiza sp1 + P2O5 mức 0.03%
- CT3: Ngô + Mycorrhiza sp1 + P2O5mức 0.06%
- CT4: Ngô + Mycorrhiza sp1 + P2O5 mức 0.09%
- CT5: Ngô + Mycorrhiza sp1 + P2O5 mức 1.2%
- Đối với chủng nấm Mycorrhiza sp2
- CT1: Ngô + P205 mức 0.03 % (đất có chứa P2O5 với mức 0.03%) - CT2: Ngô + Mycorrhiza sp2 + P2O5mức 0.03%
- CT3: Ngô + Mycorrhiza sp2 + P2O5 mức 0.06%
- CT4: Ngô + Mycorrhiza sp2 + P2O5 mức 0.09%
- CT5: Ngô + Mycorrhiza sp2 + P2O5 mức 1.2%
Phương pháp thí nghiệm - Cho 2kg đất sạch vào chậu.
- Ngâm hạt bằng nước ấm khoảng 40oC ( 3 sôi: 2 lạnh) qua đêm sau đó đem giao vào chậu ở độ sâu 5cm.
- Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong chậu nhựa (20 x 25cm), nhắc lại 4 chậu/
công thức, với 2kg đất khô/ chậu, số cây theo dõi là 1 cây/ chậu. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, lƣợng bào tử nhiễm vào là 10^9 bào tử nấm Mycorrhiza/ chậu.
- Tưới chế phẩm nấm Mycorrhiza sp1, Mycorrhiza sp2 sau 3 ngày hạt nảy mầm.
- Tưới các mức phân P2O5 sau 4 ngày hạt nảy mầm.
24
Chỉ tiêu theo dõi - Chiều cao cây.
2.3.3.7 Phương pháp nghiên cứu khả năng đối kháng 2 chủng nấm bệnh Rhizoctonia solani và Fusarium sp
Cây kí chủ đƣợc lựa chọn dùng trong thí nghiệm này là cây ngô có nguồn gốc nhập nội đƣợc cung cấp từ cục trồng trọt.
Chủng nấm gây bệnh chuẩn: Fusarium sp; Rhizoctonia solani đƣợc cung cấp từ cục BVTV.
Bố trí thí nghiệm
Đối với chủng nấm Mycorrhiza sp1 - CT 01: Đất sạch
- CT 02: Ngô+ Nấm bệnh Rhizoctonia solani - CT 03: Ngô+ Nấm bệnh Fusarium sp - CT 04: Ngô+ Mycorrhiza sp1
- CT 07: Ngô+ Mycorrhiza sp1 + Fusarium sp - CT 08: Ngô+Mycorrhiza sp1+ Rhizoctonia solani
Đối với chủng nấm Mycorrhiza sp2:
- CT 01: Ngô + đất sạch
- CT 02: Ngô + nấm bệnh Rhizoctonoa solani - CT 03: Ngô + nấm bệnh Fusarium sp
- CT 05: Ngô + Mycorrhiza sp2
- CT 06: Ngô + Mycorrhiza sp2 + Rhizoctonia solani - CT 09: Ngô + Mycorrhiza sp2 + Fusarium sp
Phương pháp thí nghiệm
- Phối trộn nấm bệnh và chế phẩm Mycorrhiza theo các công thức vào 2kg đất rồi cho vào chậu.
- Ngâm hạt qua đêm rồi đem gieo ở độ sâu 5 cm.
- Thí nghiệm tiến hành trong chậu nhựa (20 x 25cm), nhắc lại 3 chậu/công thức. Số cây theo dõi 3 cây/ chậu. Số bào tử nấm Mycorrhiza nhiễm cho
25
1 chậu là 10^9 bào tử nấm Mycorrhiza. Bào tử nấm bệnh là 10^6 bào tử/2kg đất.
- Tỷ lệ cây bị bệnh được xác định theo phương pháp chuẩn về điều tra bệnh hại thực vật do Viện Bảo vệ Thực vật ban hành.
- Các kết quả điều tra đƣợc thực hiện sau khi cây gieo đƣợc 2 tuần tuổi.
Chỉ tiêu theo dõi - Tỷ lệ hạt nảy mầm(%) - Tỷ lệ cây bị bệnh (%)
Tính toán và xử lý số liệu
Tỷ lệ hạt nảy mầm:
TLHNM(%) = Trong đó A: số hạt nảy mầm
B: tổng số hạt gieo
Tỷ lệ bệnh cây:
TLB(%) =
Trong đó D: số cây bị bệnh do nhiễm nấm R.solani và Fusarium E: tổng số cây điều tra
Tính toán sử dụng phần mềm xử lý Excel 2010
Kết quả thí nghiệm đƣợc tiến hành bằng các thủ tục phân tích thống kê với ỏ
= 0,05 trên phần mềm statgraphics.
26