1.6. Định danh nấm men
1.6.2. Định danh nấm men bằng sinh học phân tử
Định danh nấm men bằng sinh học phân tử chủ yếu dựa trên sự phát triển của những kỹ thuật gen hiện đại và có độ chính xác cao. Đó là những kỹ thuật hiện đại có sự kết hợp của nhiều ngành khoa học như sinh học, hóa học, tin học và cơ khí tự động.
Để định danh một loài nào đó thì người ta phải tiến hành các phản ứng như PCR và kỹ thuật giải trình tự, sau đó xử lý số liệu với ngân hàng gen.
1.6.2.1 Đoạn gen rDNA
Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là
Đồ án tốt nghiệp
16
một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật. [23]
Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA . [24]
Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi.[25]
❖ Primer
Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5.8S và 28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe và S.
cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28S của S. prombe, S.
cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự giống với rDNA 18 S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25bp. [24]
Đồ án tốt nghiệp
17
Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene) ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG
G
1773-1791 (18S)
White et al. 1990 ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA
GTA A
1735-1756 (18S)
Gardes & Bruns 1993
ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC
53-34 White et al. 1990 ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA
GC
34-53 White et al. 1990 ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT
GC
57-38 (25S) White et al. 1990 ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG
TCC AG
194-172 (25S) Gardes & Bruns 1993
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G
1749-1770 (18S)
White et al. 1990
5.8S CGC TGC GTT CTT CAT CG 54-38 Vilgalys lab
5.8SR TCG ATG AAG AAC GCA GCG 37-54 Vilgalys lab
Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS
Chỉ định dùng cho PCR: ITS1 hoặc ITS5, ITS1-F và ITS4 hoặc LR15, ITS4-B 1.6.2.2. Nhân gen và Kỹ thuật giải trình tự trong định danh loài
❖ Nhân gen (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật lai DNA đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn DNA đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện
Đồ án tốt nghiệp
18
được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn DNA đích một cách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân gene PCR. [30]
Việc nhân DNA cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối với đoạn DNA hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích nguồn DNA khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu.
Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự DNA và RNA của sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi DNA sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự DNA còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật. [30]
❖ Kỹ thuật giải trình tự
Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gen bảo tồn được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau. [30]
Đồ án tốt nghiệp
19