CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men
2.2.3.4. Giải trình tự và định danh mẫu nấm men
Giải trình tự gen là sự xác định rõ trình tự của các base trong DNA. Tuy nhiên không phải tất cả những chuỗi DNA đều là gen (vùng mã hóa), điều này phụ thuộc vào sinh vật lấy mẫu và nguồn DNA mẫu như: trình tự khởi đầu, các trình tự lặp lại, các intron. Hai phương pháp cơ bản để giải trình tự DNA. [30]
✓ Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert (phương pháp thủy phân hóa học dùng đoạn DNA mạch đôi): sử dụng các loại hóa chất để cắt DNA tại các vị trí xác định tạo ra một bộ các đoạn chỉ khác nhau bởi một nucleotide.
✓ Phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson (phương pháp này dùng đoạn DNA mạch đơn): dùng enzyme để tổng hợp các đoạn DNA có một đầu mang một nucleotide biến đổi.
Việc phân tích các đoạn này được tiến hành giống nhau trong cả hai phương pháp, gồm điện di trên gel và đọc kết quả trên bản phóng xạ tự ghi. Ngày nay, phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson là phương pháp được sử dụng rộng rãi hơn. Một vài sự thay đổi đã được phát triển và nó đã được tự động hóa cho sự giải trình tự nhiều đoạn gen có kích thước lớn.
❖ Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert (phương pháp hóa học)
Đồ án tốt nghiệp
30
Phương pháp tự phân hóa học dùng mẫu DNA mạch đôi vì thế không yêu cầu tạo dòng DNA trong Phage M13 để tạo ra mạch DNA đơn như là trong phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson. Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học.
Trước hết các phân tử DNA được đánh dấu bằng 32P ở một đầu. Sau đó chúng được chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa học chuyên biệt có khả năng làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và sau đó cắt phân tử DNA ngay tại nucleotide. Năm nhóm nucleotide bị tác động là G, A, C, G+A, T+C. Kết quả của các xử lí hóa học là hình thành năm tập hợp oligonucleotide, các oligonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt cùng một loạinucleotide. Cuối cùng năm phân đoạn trên được đem phân tích trên gel polyacrylamide. Vị trí các oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện bằng đầu có đánh dấu phóng xạ. Kết quả được đọc trên bản phóng xạ ghi.
❖ Phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson (phương pháp enzyme) [30]
Phương pháp này được dựa trên sự làm gián đoạn tổng hợp enzyme polymerase do các nucleotide tương đồng của đoạn DNA bổ sung với mạch khuôn. Một hỗn hợp các đoạn DNA có chiều dài khác nhau được tạo ra phụ thuộc vào nơi mà chúng bị cắt. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài bốn loại nucleotide trong đó nhóm 3’OH được thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các nối phosphodiester và do đó làm ngưng quá trình tổng hợp.
Trình tự DNA cần xác định phải được tạo dòng trong một vector mạch đơn (phage M13). DNA polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenow của DNA polymerase I, Taq polymerase. Sự tổng hợp mạch mới bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên biệt trên phage M13, với sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ (32P). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn
Đồ án tốt nghiệp
31
phân đoạn riêng. Người ta cho vào lần lượt bốn phân đoạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàm lượng rất nhỏ. Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảng mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp oligonucleotide đó ngừng lại. Tính xác xuất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau tương ứng với tất cả các nucleotide cùng loại hiện diện trên trình tự DNA. Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được phân tích trên gel Polyacrylamide và kết quả được đọc trên bản phóng xạ điện di.
❖ Giải trình tự những đoạn DNA lớn [30]
Cả hai phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert và Sanger-Coulson chỉ có thể giải trình tự cho đoạn trình tự khoảng 400 base một lần. Tuy nhiên, hầu hết những đoạn gen đều có kích thước lớn hơn. Để giải trình tự những đoạn DNA lớn này, nó được cắt (dùng hai hay nhiều enzyme cắt giới hạn) thành những đoạn khác nhau và mỗi đoạn được giải trình tự một cách riêng rẽ bao gồm những trình tự gối đầu lên nhau (mà thường được xác định bởi máy tính). Trình tự đầy đủ của đoạn gen sau đó sẽ được xác định.
❖ Các phương pháp cải biên từ phương phápSanger-Coulson [30]
Trong thực nghiệm, việc sử dụng các phương pháp chính thống nêu trên đòi hỏi thao tác phức tạp vì phải tạo dòng lại đoạn DNA cần xác định trình tự vào vector mạch đơn (phage M13). Do đó để đơn giản hóa, ngay từ đầu người ta tạo dòng các vector là các plasmid thế hệ thứ ba. Ở hai bên đoạn DNA được tạo dòng các plasmid riêng biệt, mỗi trình tự nằm trên một mạch. Khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết người ta tách rời hai mạch (biến tính bằng NaOH) rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó. Phản ứng tổng hợp xảy ra theo nguyên tắc đã nêu ở phần trên.
Đồ án tốt nghiệp
32
Vì điều kiện trang thiết bị không cho phép nên các sản phẩm PCR sẽ được gửi đi giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa.
Địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn - Phường Tân Hưng Quận 7 - Thành phố HCM - Việt Nam.
Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng để định danh loài và xây dựng cây phân loài.
BioEdit 7.2.5.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
Đồ án tốt nghiệp
33