CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men
2.2.3.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR do Karl Mullis và công sự phát minh vào năm 1985, là một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen. [31]
Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm men. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới. Phương
Đồ án tốt nghiệp
26
pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose.
❖ Các thành phần của phản ứng PCR.
✓ DNA mẫu: chứa vùng DNA cần được khuếch đại.
✓ Mồi: là những đoạn oligonucleotide, bổ sung cho vùng DNA tại đầu 5’
và 3’ của vùng DNA cần được khuếch đại.
✓ DNA polymerase: (Taq DNA polymerase hay một polymerase khác mà có khả năng hoạt động tốt ở nhiệt độ khoảng 70OC) dùng để tổng hợp đoạn DNA của vùng cần khuếch đại.
✓ Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs): là vật liệu để polymerase tổng hợp DNA.
✓ Dung dịch Buffer: cung cấp môi trường thích hợp cho hoạt tính cao và bến vững của polymerase.
✓ Cation hóa trị 2 (Mg2+ hay Mn2+): thông thường Mg2+ được sử dụng, nhưng Mn2+ có thể được dùng cho phản ứng PCR tức thời. Tuy nhiên, nồng độ Mn2+ cao gia tăng tỉ lệ bắt cặp sai trong quá trình tổng hợp DNA.
✓ Cation hóa trị 1: K+.[34]
Một trong những DNA polymerase bền nhiệt đầu tiên được thu nhận từ Thermus acquaticus và thường được gọi là Taq polymerase [35]. Taq polymerase hiện nay được sử dụng rộng rãi trong các phản ứng PCR. Một trong những nhược điểm của Taq polymerase là thỉnh thoảng chúng tổng hợp sai khi tổng hợp đoạn DNA dẫn đến những đột biến trong đoạn DNA, bởi vì chúng thiếu hoạt tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Một số polymerase khác như: Pwo và Pfu được thu nhận từ Archaea có cơ chế đọc và sửa
Đồ án tốt nghiệp
27
sai (cơ chế kiểm tra lại sự sai) mà có thể giảm phần lớn những đột biến xảy ra trong quá trình tổng hợp DNA. Tuy nhiên những enzyme này có hoạt tính tổng hợp DNA thấp hơn Taq. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu polymerase cung cấp cả hoạt tính tổng hợp DNA cao và sự chính xác trong sự tổng hợp DNA.
❖ Chu trình phản ứng
Thông thường, PCR kéo dài 20- 35 chu kì, hầu hết các phản ứng PCR bao gồm 3 bước:
✓ Bước 1 (biến tính DNA): Đầu tiên, phản ứng PCR thường được gia nhiệt đến nhiệt độ 94-96oC, nhiệt độ này được giữ 1-9 phút nhằm đảm bảo tất cả DNA mục tiêu và mồi bị biến tính [36] , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên kết hydrogen giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA mạch đơn. Sau đó, chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94-980C khoảng 20-30 giây.
✓ Bước 2 (bước lai): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp với mạch khuôn DNA đơn. Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu được hình thành. Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với mạch khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào và bắt đầu tổng hợp DNA. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi và thông thường khoảng 50-64oC trong thời gian 20-40 giây.
✓ Bước 3 (bước kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung đối với DNA mạch khuôn. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động tối ưu của DNA polymerase. Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 70-74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC. Nối hydrogen giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ cao. Mồi đã lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và không được kéo dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử
Đồ án tốt nghiệp
28
dụng và chiều dài đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối cùng kéo dài khoảng 5-15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu), chu kì cuối cùng này được dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có thể được kéo dài hoàn toàn.
Để kiểm tra có hay không phản ứng PCR tạo ra đoạn DNA cần khuếch đại, điện di trên gel agarose có thể được sử dụng cho sự phân tách các sản phẩm PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định bởi thang DNA, chứa đựng những đoạn DNA có kích thước đã được biết chạy dọc trên gel cùng với sản phẩm PCR. Các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy dưới tia UV (bước sóng 312nm).
Phương pháp PCR có độ nhạy rất cao, thao tác lại đơn giản nhưng mức độ ngoại nhiễm cao, sự kém trung thực trong quá trình tổng hợp của Taq polymerase… Vì vậy, cần cẩn trọng khi tiến hành thí nghiệm cũng như phân tích kết quả.
❖ Trong khóa luận này PCR dùng để khuếch đại đoạn gen ITS rDNA của nấm men.
Thành phần phản ứng Mater mix 6.5àl ITS1-F 0.1àl ITS4-R 0.1àl
DNA 1àl
H2O 17.3àl Tổng 25 àl
❖ Chu trình phản ứng PCR
Bước 1: Biến tính DNA, 94oC trong 5 phút Bước 2: 35 chu kỳ
94oC trong 1 phút 55oC trong 1 phút
Đồ án tốt nghiệp
29 72oC trong 2 phút
Bước 3: Kết thúc, 72oC trong 10 phút Bước 4: Bảo quản 4oC
❖ Kiểm tra kết quả PCR
Ta sử dụng phương pháp điện di để kiểm tra mẫu PCR, các bước thực hiện giống bước 2.2.3.2 trên nhưng bổ sung thêm một giếng nạp mẫu thang đối chứng có kích thước từ 500bp- 10000bp.