CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất
2.1.1 Vật liệu
Mẫu thí nghiệm
- Bào tử nấm Linh chi được thu thập từ các trại nấm trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh được cung cấp bởi Th.S Nguyễn Thị Ngọc Yến. Rây bào tử để loại bỏ một số tạp chất. Sấy ở nhiệt độ 40oC. Bảo quản trong điều kiện khô ráo.
- Giống nấm Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ nấm Linh chi trong đồ
án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu (10DSH), nhận từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH Công Nghệ Tp. HCM, cơ sở 1, 475A Điện Biên Phủ, P. 25, Q.Bình Thạnh, Tp.HCM.
2.1.2 Nơi tiến hành
Thí nghiệm được thực hiện tại trung tâm thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH Công nghệ TP. HCM, cơ sở 475A, Điện Biên Phủ, P.25, Q. Bình Thạnh, TP.HCM 2.1.3 Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ 10/03/2016 đến 15/06/2016 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ
2.1.4.1 Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh
- Kính hiển vi quang học - Autoclave
- Máy ly tâm - Máy đo pH - Cân phân tích - Cân điện tử - Bếp từ
- Máy nước cất - Bể điều nhiệt
45 - Máy lắc
- Máy đo quang phổ UV 2.1.4.2 Dụng cụ
- Erlen 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml, 2000ml - Cốc thủy tinh 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml - Cốc sứ
- Ống đong 50ml, 100ml - Đĩa peti
- Pipette thủy tinh 5ml, 10ml
- Micropipette 100àl, 1000àl – đầu tuýp tương ứng - Ống ly tâm 50ml
- Ống nghiệm - Đũa thủy tinh
- Bông thấm nước, bông không thấm nước - Bao nylon hấp, giấy báo, dây thun
2.1.5 Hóa chất – Môi trường sử dụng 2.1.5.1 Hóa chất
- Dầu soi kính hiển vi - Tween 80
- β – glucan (30% w/w) - Thuốc thử Lugol
+ Iodine 1g
+ KI 2g
+ Nước cất 300 ml Hòa tan rồi giữ trong lọ tối màu
- Bovine serum albumin (BSA) 0,1 mg/ml: Cân chính xác 10 mg albumin pha trong 100 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 20oC. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml.
- Dung dịch thuốc thử Bradford:
46 +Coomassie Brilliant Blue G – 250: 0,01g + Ethanol tuyệt đối 4,7g
+ Acid phosphoric 85%: 8,5g
Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.
- HCl 0,2N
- Đệm phosphate pH 7 (0,05M)
- Dung dịch casein 1%: hòa tan 1g casein vào 90 ml dung dịch đệm phosphate 0,05M. Đun tan casein, sau đó điều chỉnh pH bằng HCl 1N hoặc NaOH tới pH=7. Chuyển sang bình định mức 100ml và bổ sung dung dịch đệm phosphate tới vạch
- Na2CO3 6%: hòa tan 6g Na2CO3 trong nước cất, định mức tới 100ml
- Dung dịch Trichloacetic acid (TCA) 5%: Hòa tan 5g TCA trong nước cất, định mức tới 100ml, lắc đều
- Dung dịch tyrosine 1mM (1àmol/ml): cõn 181,19 mg/ml tyrosine tinh khiết hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N và chuyển sang bình định mức 100ml, định mức tới vạch ta thu được dung dịch gốc 10mM. Khi sử dụng pha loãng dung dịch gốc 10 lần bằng HCl 0,2N được dung dịch tyrosine 1mM
- Thuốc thử Folin – Ciocalteu (gọi tắt là FC): pha loãng 5 lần bằng nước cất: 1 thể tích FC gốc + 4 thể tích H2O)
- Đệm Natri acetate 0,05M
- Dung dịch Sodium carboxymethyl cellulose (CMC) 1% w/v CMC: cân chính xác 10g CMC, hòa tan trong đệm Natri acetate 0,05M
- Dung dịch acid – 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic (DNS): cân 20g DNS cho vào beaker 2000 ml, thêm khoảng 800 ml nước cất. Đặt beaker vào chậu nước 80oC khuấy đều; hòa tan 32g NaOH với 300 ml nước cất, thêm dung dịch NaOH này từ từ vào dung dịch DNS, khuấy nhiệt ở 80oC. Tiếp tục thêm 600g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy.
Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình
47
định mức 2000 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai tối màu.
- Dung dịch lactose: hòa tan 0.12g lactose monohydrate với 80 ml nước cất, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều.
- Dung dịch DNS – lactose: trộn đều 150ml DNS với 50ml dung dịch lactose.
- Dịch cơ chất β – D – glucan 1%: cân chính xác 3,334g β – D – glucan hòa trong 50 ml đệm Natri acetate 0,05M pH5, chuyển vào bình định mức 100ml, bổ sung đệm đến vạch.
- Dung dịch Mononatri orthophosphate 0,2M: hòa tan 27,8g NaH2PO4 và định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M: hòa tan 53,05g Na2HPO4.7H2O và định mức đến 1000 ml
- Dung dịch acid acetic 0,2M: hòa tan 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml
- Dung dịch Natri acetate 0,2M: cân 16,4g CH3COONa hòa tan bằng nước cất và định mức đến 1000 ml
- Dung dịch đệm pH7: hút 39,0 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M trộn với 61,0 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M rồi định mức đến 200ml
- Dung dịch đệm pH6: hút 87,7 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M trộn với 12,3 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M rồi định mức đến 200ml
- Dung dịch đệm pH5: hút 14,8 ml dung dịch acid acetic 0,2M trộn với 35,2 ml dung dịch natri acetate 0,2M rồi định mức đến 100ml
- Dung dịch đệm pH4: hút 41,0 ml dung dịch acid acetic 0,2M trộn với 9,0 ml dung dịch natri acetate 0,2M rồi định mức đến 100ml
2.1.5.2 Môi trường sử dụng
Môi trường PDA
D-Glucose 4g
48
Agar 4g
Dịch chiết khoai tây 200ml Cloramphenicol 0.005g pH: 6-7
Chuẩn bị dịch chiết khoai tây: cân 200g khoai tây được cắt hạt lựu, cho vào cốc 2 lít, đong nước cất tới 1000ml rồi đun sôi hỗn hợp trên bếp từ. Đun sôi khoảng 10 phút rồi đem lọc lấy dịch trong.
Môi trường tăng sinh lỏng nấm Trichoderma harzianum
- Glucose 1g
- NH4NO3 0,5 g
- MgSO4.7H2O 0,5 g
- K2HPO4 0,7 g
- KH2PO4 0,3 g
- FeSO4.7H2O 0,01 g
- ZnSO4 0,001 g
- Cloramphenicol 0,005 g
- Bổ sung dịch chitin huyền phù 1% đến 1 lít.
pH: 6 – 7
Môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum - Nấm linh chi nghiền 20g
- Malt 5g
- Dung dịch khoáng 10ml
- Cao nấm men 0,5g
- Chitin huyền phù 0,25g
- Nước bổ sung 40ml
- Độ ẩm 70%, pH5
Pha dung dịch khoáng
+ NH4NO3 0,5g + KH2PO4 0,2g
49
+ NaCl 0,1g
+ MgSO4.7H2O 0,1g
Hòa tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml
Môi trường chitin – agar 1%
Đong 100ml dịch huyền phù chitin 1% vào bình môi trường Ducan bổ sung 2g agar, sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường.
Môi trường casein – agar 1%
Đong 100ml dịch casein 1% vào bình môi trường bổ sung 2g agar, sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường.
Môi trường β-glucan agar 1%
Đong 100ml dịch β-glucan 1% vào bình môi trường bổ sung 4g agar, sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường.