CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.9 Khảo sát phá vách bào tử nấm Linh chi bằng dịch nuôi cấy nấm Trichoderma
2.9.1 Phương pháp xác định tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032
Sơ đồ 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10%
20ml 1g bào tử nấm linh chi nước cất
Lạnh đông 12 tiếng ở -4oC
Rã đông ở nhiệt độ phòng Ly tâm 4000 vòng/phút/20 phút
Thu bào tử, phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử
Nước
Ngâm bào tử trong DNC và EC 10% ở 50oC, pH5 theo các tỉ lệ
1 DNC (1,5ml +
3,5ml đệm)
1 EC10%
(1,5ml + 3,5ml
đệm)
1DNC : 1 EC10%
(1,5ml:1,5ml
+2ml đệm)
2 DNC:
1EC10%
(3,0ml:1,5 ml +0,5ml
đệm)
1 DNC : 2 EC10%
(1,5ml:3,0 ml +0,5ml
đệm)
Đếm hồng cầu tế bào ngày 2,3,4
65
Cân 1g bào tử nấm Linh chi cho vào ống ly tâm, đong 20 ml nước cất thêm vào ống ly tâm, để vào trong tủ đá làm lạnh đông bào tử ở - 4oC trong 12 tiếng. Sau thời gian lạnh đông, đem bào tử rã đông ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/
phút trong 10 phút để tách nước, thu bào tử ướt. Phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử rồi ngâm bào tử trong hỗn hợp dịch nuôi cấy nấm và enzyme chế phẩm C20032 10% với các tỉ lệ thể tích khác nhau như bảng 2.9
Bảng 2.9 Bảng bố trí thay đổi tỉ lệ enzyme dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10%
Nghiệm thức
Nghiệm thức 1 (NT1)
Nghiệm thức 2 (NT2)
Nghiệm thức 3 (NT3)
Nghiệm thức 4
(NT4)
Nghiệm thức 5 (NT5)
Tỉ lệ 1 DNC 1 EC 10% 1DNC :
1EC 10%
2DNC : 1EC 10%
1DNC : 2EC 10%
Thể tích (ml)
1,5 1,5 1,5 : 1,5 3,0 : 1,5 1,5 : 3,0
Đệm pH5 (ml)
3,5 3,5 2,0 0,5 0,5
Tổng thể tích (ml)
5 5 5 5 5
Đem ủ các ống nghiệm trên trong bể điều nhiệt ở 50oC trong 2, 3, 4 ngày. Thực hiện đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu ở ngày thứ 2, 3, 4.
2.9.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu.
(Trần Thanh Phong, 2004; Nguyễn Đức Lượng, 2005)
66
Hình 2.1 Buồng đếm hồng cầu Neubauer
Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm các vi sinh vật có kích thước rất nhỏ (nấm men, bào tử nấm mốc…).
Nguyên tắc: Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu đó là một phiến kính hình chữ nhật, chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ có kẻ một lưới đếm, gồm nhiều ô vuông nhỏ, mỗi ô có diện tích là 1/25 mm2, lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16 ô), mỗi ô có diện tích là 1/400 mm2 và chiều sâu là 0,1mm. Như vậy thể tích của mỗi ô nhỏ là 1/400x0.1=1/4000 mm3. Thực hiện: Bào tử nấm Linh chi sau khoảng thời gian ủ thích hợp, được lấy ra thực hiện đếm hồng cầu. Định mức ống nghiệm chứa bào tử nấm linh chi và hỗn hợp dịch enzyme đến 10 ml, ta được ống mẫu 100. Thực hiện pha loãng bằng cách dùng micropipette hút 1ml từ ống mẫu 100 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý ta được độ pha loãng 10-1. Lặp lại như trên cho đến khi có được các độ pha loãng 10-2, 10-3. Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer.
Lắc đều mẫu pha loãng. Đậy lá kính lên lưới đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm.
Chú ý không để tạo bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử.
Chú ý: nồng độ dịch huyền phù mẫu pha loãng phải đảm bảo sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không được quá 10 bào tử.
Cách đếm và tính:
67
- Đếm số bào tử trong 4 ô W (ô W là 4 ô nằm ở 4 góc buồng đếm Neubauer), gọi B là số bào tử trung bình trong một ô lớn W. Trong mỗi ô trung bình, đếm tất cả những bào tử nằm gọn trong ô và những bào tử nằm ở cạnh trên và cạnh trái. Những bào tử nằm ngay trên vạch ngoài thì đếm 2 tính 1, còn bào tử nằm giữa 2 vạch hoặc trên 1 vạch thì 1 tính 1.
- Số bào tử trong 4 ô W là B1, B2, B3 và B4. Btrung bình = (B1+B2+B3+B4)/4 Mật độ bào tử trong mẫu là:
- Bào tử/1 mm3 = B/(1 mm2 x 0,1 mm) = Bx10 - Bào tử/1 ml = Bx1000x10
Số bào tử trong dịch mẫu là:
- Bào tử/ml = Bx1000x10xF (F là hệ số pha loãng)
Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi là đếm bào tử còn nguyên sau khi đã xử lý bằng hỗn hợp dịch enzyme so với bào tử chưa xử lý.
2.9.3 Phương pháp xác định độ ẩm bào tử nấm Linh chi
Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.
Thực hiện: sấy chén sứ sạch ở 105oC đến khối lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng chính xác đến 0,0001g (M). Cho vào cốc một lượng mẫu rồi đem cân cốc chứa mẫu bằng cân phân tích với độ chính xác đến 0,0001g (M1).
Cho cốc chứa mẫu vào tủ sấy, sấy đến khối lượng không đổi trong thời gian 3 giờ.
Sau khi sấy, làm nguội trong bình hút ẩm 15 – 20 phút rồi đem cân phân tích với độ chính xác như trên. Cho lại vào tủ sấy 105oC trong 30 phút, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm 15 – 20 phút rồi đem cân đến khối lượng không đổi (M2)
Tính kết quả:
Độ ẩm theo phần trăm được tính theo công thức:
X% = (M1 – M2)/(M1 – M)x100 Với M: khối lượng cốc (g)
M1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g) M2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)
68
2.9.4 Phương pháp thay đổi nồng độ của chế phẩm C20032 kết hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum
Cân 1g bào tử nấm Linh chi cho vào ống ly tâm, đong 20 ml nước cất thêm vào ống ly tâm, để vào trong tủ đá làm lạnh đông bào tử ở - 4oC trong 12 tiếng. Sau thời gian lạnh đông, đem bào tử rã đông ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/
phút trong 10 phút để tách nước, thu bào tử ướt. Phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử rồi ngâm trong hỗn hợp dịch nuôi cấy nấm và enzyme chế phẩm C20032 có tỉ lệ thể tích 1 DNC : 1 EC 20032 với sự thay đổi nồng độ của chế phẩm C20032 theo bảng 2.10
Bảng 2.10 Bảng bố trí sự thay đổi nồng độ enzyme C20032 Nghiệm
thức
Nghiệm thức 1 (NT1)
Nghiệm thức 2 (NT2)
Nghiệm thức 3 (NT3)
Nghiệm thức 4
(NT4)
Nghiệm thức 5 (NT5) Tỉ lệ 1 DNC:
1 EC 10%
1 DNC:
1 EC 5%
1 DNC : 1 EC 1%
1 DNC : 1 EC 0,5%
1 DNC : 1 EC 0,1%
Thể tích (ml)
1,5 : 1,5 1,5 : 1,5 1,5 : 1,5 1,5 : 1,5 1,5 : 1,5
Đệm pH5 (ml)
2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
Tổng thể tích (ml)
5 5 5 5 5
69
Sơ đồ 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi nồng độ enzyme chế phẩm C20032 kết hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum
Đem ủ các ống nghiệm trên trong bể điều nhiệt ở 50oC trong 4,7,10 ngày. Thực hiện đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer ở ngày thứ 4,7,10. Sau đó xác định nghiệm thức có tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi ưu thế.
1g bào tử nấm linh chi 20ml
nước cất
Lạnh đông 12 tiếng ở -4oC
Rã đông ở nhiệt độ phòng Ly tâm 4000 vòng/phút/20 phút
Thu bào tử, phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử
Nước
Ngâm bào tử trong DNC và EC ở 50oC, pH5 theo tỉ lệ 1:1 với sự thay đổi nồng độ EC
1 DNC:
1 EC 10% 1 DNC : 1 EC 5%
1 DNC : 1 EC 1%
1 DNC:
1 EC 0,5%
1 DNC : 1 EC 0,1%
Đếm hồng cầu tế bào ngày 4,7,10
70
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN