CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi cấy
Sơ đồ 2.4 – Sơ đồ nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi cấy
Nhân giống Giống gốc
Tăng sinh
Lắc 150 vòng/phút, 3 ngày
Lọc
Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút
Dịch nuôi cấy
Trích ly (lắc 150 vòng/phút,
24 giờ)
Lọc
Ly tâm 4000 vòng/
phút, 10 phút Tăng sinh MT
lỏng
Tăng sinh MT rắn, 3 ngày
Nước cất
Tỉ lệ nước cất : cơ chất 10:1
Bã
Cặn
Dịch nuôi cấy
Tơ nấm
54
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum trên môi trường thạch PDA Chuẩn bị môi trường PDA như mục 2.1.5.2 cho vào bình môi trường Ducan 200ml rồi đem hấp khử trùng ở 1210C/1 atm/15 phút. Hấp xong, để môi trường hạ xuống khoảng 500C rồi tiến hành đổ đĩa. Đợi thạch đông lại, tiến hành cấy điểm Trichoderma harzianum T2 từ ống giống được phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu năm 2014 trường ĐH Công nghệ TP. HCM, rồi lật úp đĩa (tránh tụ nước trên bề mặt thạch) đem ủ ở 28-320C. Sau 7 ngày nuôi nấm trên môi trường PDA chuyển sang môi trường tăng sinh khối thu dịch enzyme nuôi cấy theo sơ đồ 2.3
2.3.2 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường lỏng Chuẩn bị môi trường tăng sinh lỏng nấm Trichoderma hazianum như mục 2.1.5.2 phối vào erlen 1000ml 250 ml môi trường tăng sinh lỏng có huyền phù chitin 1%, hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút. Để nguội khoảng 300C rồi cấy bào tử nấm Trichoderma harzianum T2 đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA. Sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày nuôi cấy, lọc bỏ tơ nấm, đem ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút thu dịch tăng sinh loại bỏ cặn là sinh khối tơ nấm còn sót lại.
Phương pháp làm huyền phù chitin 1% (De-hui Dai et al, 2010): cân chính xác 5g bột chitin vào 1 bình erlen 500 ml, thêm từ từ 100 ml HCl 11M, khuấy trong 1 tiếng, ủ qua đêm ở 4oC. Sau đó, thêm vào erlen 500 ml ethanol 96% lạnh (khoảng 4oC), khuấy đều, ủ qua đêm ở 4oC. Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút thu tủa.
Rửa tủa bằng nước cất đến khi pH đạt 6. Thêm vào tủa 500 ml nước cất để được huyền phù chitin 1%.
2.3.3 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn Chuẩn bị môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma hazianum như mục 2.1.5.2 phối vào erlen 1000ml môi trường tăng sinh rắn, hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút. Để nguội khoảng 300C rồi cấy bào tử nấm Trichoderma harzianum T2 đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA. Giữ bình ở nhiệt độ phòng đem ủ ở 28-320C trong 3 ngày. Thực hiện trích ly bằng nước cất lạnh vô trùng theo tỉ lệ nước cất/cơ chất là 10:1 có bổ sung Tween 80 1%. Đem lắc trên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ rồi lọc bỏ bã. Sau
55
đó đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch tăng sinh loại bỏ cặn còn sót lại.
2.3.4 Phương pháp định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease có trong dịch nuôi cấy và chế phẩm enzyme C20032 10%
Định tính enzyme chitinase
Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri chứa môi trường huyền phù chitin agar 1% được chuẩn bị như mục 2.1.5.2. Mỗi đĩa môi trường chitin agar đục 4 lỗ thạch đường kính 5 mm, sau đú dựng micropipette hỳt 100àl dịch nuụi cấy/(enzyme C20032 10%) nhỏ vào 3 lỗ thạch đã đục trong mỗi đĩa và 1 lỗ không nhỏ dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) sau 48 giờ bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải chitin.
Định tính enzyme β-glucanase
Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri chứa môi trường β-glucan agar 1% được chuẩn bị như mục 2.1.5.2. Mỗi đĩa môi trường β-glucan agar đục 4 lỗ thạch đường kính 5 mm, sau đú dựng micropipette hỳt 100àl dịch nuụi cấy/(enzyme C20032 10%) nhỏ vào 3 lỗ thạch đã đục trong mỗi đĩa và 1 lỗ không nhỏ dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) sau 48 giờ bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải β-glucan.
Định tính enzyme protease
Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri chứa môi trường casein agar 1% được chuẩn bị như mục 2.1.5.2. Mỗi đĩa môi trường casein agar đục 4 lỗ thạch đường kính 5 mm, sau đú dựng micropipette hỳt 100àl dịch nuụi cấy/(enzyme C20032 10%) nhỏ vào 3 lỗ thạch đã đục trong mỗi đĩa và 1 lỗ không nhỏ dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) sau 48 giờ bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải casein.
56