Các đại phân tử sinh học được tinh sạch bằng cách sử dụng các kỹ thuật sắc ký, kỹ thuật này phân tách chúng theo sự khác biệt về các đặc tính của chúng.
Bảng 1.2: Đặc tính và kỹ thuật của một số phương pháp tinh sạch protein
Đặc tính Kỹ thuật
Kích thước Lọc gel, còn được gọi là phân tách theo kích thước
Kỵ nước
Sắc ký tương tác kỵ nước Sắc ký đảo phase
Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu
của ligand) Sắc ký ái lực
Điện tích Sắc ký trao đổi ion
Hình 1.6: Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đưa vào thị trường sản phẩm thương mại Saphadex, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.
Lọc gel là kỹ thuật sắc ký đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Lọc gel phân tách các phân tử dựa trên sự khác biệt về kích thước và trọng lượng phân tử.
Kỹ thuật này có thể áp dụng theo 2 cách:
1. Phân tách nhóm: các thành phần của một mẫu được phân tách thành 2 nhóm chính theo phạm vi kích thước. Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các phân tử lớn hoặc các phân tử tạp chất nhỏ (như bỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao đổi đệm.
2. Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao: các thành phần của một mẫu được phân tách theo sự khác biệt về kích thước phân tử của chúng.
Phân tách với độ phân giải cao có thể được dùng để cô lập một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác định trọng lượng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử.
Sắc ký lọc gel cũng có thể được dùng để thực hiện việc gấp cuộn lại các protein biến tính dễ dàng hơn bằng việc kiểm soát cẩn thận sự thay đổi điều kiện của dung dịch đệm.
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật không tinh vi, phù hợp để thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động và các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các co - factor thiết yếu, các chất tẩy, urea, guanidine hydrochloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 37 oC hoặc trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Sắc ký lọc gel phân tách các phân tử dựa theo sự khác biệt về kích thước khi chúng di chuyển qua môi trường lọc gel được nhồi trong cột, không giống như sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực, các phân tử không liên kết với môi trường sắc ký do đó thành phần đệm không ảnh hưởng trực tiếp đến độ phân giải (mức độphân tách giữa các peak). Do đó, thuận lợi chủ yếu của sắc ký lọc gel là các điều kiện có thể thay đổi để phù hợp theo loại mẫu hoặc theo những yêu cầu cho quá trình tinh sạch sau này, theo sự phân tích hoặc theo quá trình bảo quản mà không làm thay đổi sự phân tách.
Sắc ký lọc gel khá phù hợp cho các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi của pH, nồng độ ion kim loại hoặc các aco – factor và các điều kiện khắc nghiệt. Sự phân tách có thể được thực hiện khi có mặt các ion hoặc các co - factor cần thiết, các chất tẩy, urea, guanidine hydrochloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 37 oC hoặc ở trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Protein tinh sạch có thể được thu nhận trong bất kỳ loại dung dịch đệm nào.
1.3.1 Phân tách bằng sắc ký lọc gel
Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này được chọn vì tính ổn định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp thụ và phản ứng). Nền nhồi được cân bằng bỡi dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được xem như phase tĩnh và chất lỏng ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các hạt, được xem như phase động. Cần lưu ý rằng, mẫu được giải hấp một cách đồng nhất, nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân tách. Tuy nhiên, bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy thường bao gồm ở thời điểm kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lưu trong cột được dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.
Hình 1.7: Quá trình lọc gel Hình 1.7 được giải thích như sau:
1. Các hạt hình cầu của môi trường lọc gel được nhồi trong cột.
2. Mẫu được nạp vào cột.
3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng được miêu tả như quá trình phân đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu trong chất nền hơn và do đó lưu lại trong cột lâu hơn.
4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích thước lỗ gel không thể khuếch tán vào trong các lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống dưới đáy cột.
5. Các phân tử lớn rời cột trước nhất, sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình tự kích thước của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lượng dung môi bằng tổng thể tích cột (tương đương với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi trường lọc gel.
1.3.2. Phân tách nhóm
Sắc ký lọc gel được dùng trong phương thức phân tách nhóm để loại bỏ các phân tử nhỏ ra khỏi một nhóm các phân tử lớn hơn và đây cũng là một giải pháp nhanh, đơn giản trong việc trao đổi đệm. Các phân tử nhỏ như muối (quá trình khử và loại muối) hoặc các gốc tự do dễ dàng được tách ra. Các mẫu có thể được chuẩn bị để bảo quản hoặc dùng cho những phân tích hoặc kỹ thuật sắc ký khác. Sắc ký lọc gel trong phương thức phân tách nhóm thường được dùng kết hợp trong quá trình tinh sạch protein để loại muối hoặc trao đổi đệm.
Các loại gel như Sephadex G50, và G100 được dùng để phân tách nhóm. Thể tích mẫu lớn, có thể lên đến 30 % tổng thể tích qua cột (nền gel đã nhồi trong cột) có thể áp dụng với tốc độ dòng cao bằng cách sử dụng các loại cột ngắn, rộng. Hình 1.7, trình bày dữ liệu giải hấp (sắc ký đồ) của một quá trình phân tách nhóm tiêu biểu. Các phân tử lớn được giải hấp trong hoặc ngay sau thể tích trống, Vo khi chúng di chuyển qua cột ở tốc độ tương đương với tốc độ của dung dịch đệm. Đối với một cột được nhồi tốt và đảm bảo, thể tích trống tương đương với khoảng 30 % của tổng thể tích cột. Các phân tử nhỏ chẳng hạn như muối sẽ chui vào lỗ và di
chuyển xuống dưới cột, nhưng nó không tách ra khỏi cái khác. Những phân tử này thường được giải hấp ngay trước khi lượng dung dịch đệm bằng tổng thể tích cột di chuyển qua cột, ký hiệu Vt. Trong trường hợp này, protein được đo bằng độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm, còn muối được phát hiện bằng đầu dò do độ dẫn điện của dung dịch đệm.
Hình 1.8: Sắc kí đồ điển hình của quá trình phân tách nhóm (sắc ký loại muối) Mặc dù trong việc xây dựng phương pháp mới đã được nhiều thành tựu đáng kể. Tuy nhiên, vấn đề tách, làm thuần khiết protein hiện nay vẫn là một công tác phức tạp, khó khăn. Nguyên nhân chủ yếu một mặt protein trong tế bào thực vật với lượng rất ít, mặc khác nó luôn có đồng thời với các protein khác cũng có các tính chất lý hóa rất giống nhau, hơn nữa protein lại rất không bền, dễ bị mất khả năng xúa tác do tác động của các yếu tố bên ngoài.
1.3.3. Bản chất của phương pháp
Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân tử và phân tích định lượng tương tác phân tử.
Hình 1.9: Tách các phân tử bằng lọc gel Một số thông số vật lý của phương pháp:
+ Giới hạn tách (exclution limit): Là trọng lượng phân tử (MW) của phân tử nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel. Thí dụ giới hạn tách của G50 có FR từ 1.500 - 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel.
+ Phạm vi tách (Fructionation range): Thí dụ, sephadex G50 có FR từ 1.500 - 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được phân tách dễ dàng bởi G50.
+ Độ ngậm nước (water regain): Là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô hút nước. Thí dụ G50 có WR là 5,0 ± 0,3 g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột.
+ Thể tích nền (bed volume): Là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu khi trương nở trong nước. G50 có thể tích nền 9 - 11 ml/g gel khô.
+ Hạt gel (Gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng mesh hoặc đường kớnh hạt (bead diameter) tớnh theo àm. Hạt cú kớch thước lớn (50 - 100 mesh, 100 - 300 àm cho tốc độ dũng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tỏch thấp. Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10 - 40 àm) lại cho tốc độ dũng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thường người ta chọn hạt gel có kích thước 100 - 200 mesh (50 - 150 àm).
+ Thể tích trống (void volume): Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons.
+ Thể tích thổi (elution volume): Là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách ra khỏi cột.
1.3.4. Đặc tính của gel
Có 4 loại gel thường được sử dụng:
Dextran có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB (Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Sephadex. Giới hạn tách của gel dextran - 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang nên khó giữ nguyên vẹn hạt nếu kích thước lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran được bổ sung thêm.
Các liên kết ngang bởi N,N’-methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách gia tăng (xem sephacryl cũng do Pharmacia – LKB cung cấp).
Gel polyacrylamide: Tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và N,N’-methylene bisacrylamide (Bio - Rad cung cấp – Biogel – P là tên thương mại) Gel agarose: Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose và anhydrogalactose. Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio -Rad cung cấp agarose với tên thương mại là Bio - gel A, còn Pharmacia – cung cấp tên thương mại là sepharose và seperose.
Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất để tách.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP