nguyên hồng cầu gắn virus
Máu ngan: nhổ lông vùng cổ và vô trùng vùng da nơi tĩnh mạch cần lấy máu, cắt da và tĩnh mạch bằng dao sắc và cho máu chảy trên thành bình vào bình chứa dung dịch Alserver, đến khi đạt tỷ lệ 1:1, lắc đều. Dung dịch Alsever vừa có tác dụng chống đông vừa có tác dụng bảo dưỡng hồng cầu. Vì vậy, có thể bảo quản hồng cầu ở nhiệt độ 40C trong khoảng 1 tuần. Tuy nhiên nếu có dấu hiệu dung huyết thì không thể sử dụng vì hồng cầu mất tế bào chất (“Ghost”) sẽ gây trở ngại cho quá trình sa lắng tự nhiên trong các phản ứng sau này. Rửa hồng cầu ba lần bằng dung dịch PBS pH 7,2 kết hợp quay ly tâm với tốc độ 1.800 vòng/phút trong vòng 5 phút, ở lần rửa cuối cùng sau khi đã loại bỏ nước mặt ở trên thì tiến hành cân và pha loãng hồng cầu với dung dịch PBS pH 7,2 để có huyễn dịch hồng cầu 50%.
Xử lý loại bỏ thụ thể bề mặt hồng cầu (Lasota hóa) [32]. Việc xử lý này nhằm làm mất thụ thể gây ngưng kết với virus Newcastle, do trên bề mặt virus Lasota có protein bề mặt có hai chức năng gây ngưng kết hồng cầu và cắt đứt neuraminic acid của tổ chức cũng như thụ thể bề mặt gây ngưng kết hồng cầu khi tiếp xúc một số virus. Thông thường, phản ứng mất ngưng kết xuất hiện sau khoảng 2 giờ.
Hồng cầu sau khi đã được rửa ba lần bằng PBS, cân trừ bì để tính khối lượng (ướt) và được pha loãng 1,5% (khối lượng/thể tích) và được dùng để kiểm tra hiệu giá dung dịch vaccine Lasota sử dụng để cắt thụ thể ngưng kết trên bề mặt hồng cầu. Quy trình kiểm tra hiệu giá bao gồm các bước: pha vaccine thành dãy 50 µl pha loãng cấp số hai trong PBS trên khay 96 lỗ, thêm 50 µl huyền dịch hồng cầu 1%, để ở nhiệt độ phòng và xác định hiệu giá vaccine sau 15 - 60 phút khi đối chứng âm gồm hồng cầu và PBS chìm hẳn xuống đáy lỗ khay [29]. Hiệu giá HA virus Lasota được sử dụng để tính lượng
vaccine vừa đủ để làm sạch thụ thể bề mặt toàn bộ khối lượng hồng cầu chuẩn bị xử lý thành giá thể kháng nguyên.
Công thức tính lượng tối thiểu virus Lasota để gây ngưng kết và làm sạch thụ thể hồng cầu là: V=T * (M/m)
Trong đó:
T là hiệu giá (số thập phân có tử số =1) của virus Lasota cần dùng. V là thể tích (tính bằng ml) dịch Lasota gốc cần dùng.
M là khối lượng hồng cầu cần xử lý (đo bằng gam).
m là khối lượng (gam) hồng cầu phản ứng trong mỗi lỗ khay (bằng 0,05 x 0,01).
Do đó: V=T*M*2*103 là công thức được sử dụng trong trường hợp trắc định cụ thể với 0,05 ml hồng cầu 1% nêu trên.
Hồng cầu được pha thành huyền dịch trong PBS pH 7,2 để có nồng độ 1:10 và được bổ sung một lượng vaccine Lasota đủ đến dư để gây ngưng kết, lắc đều và để ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 - 6 giờ để ngưng kết xảy ra và sau đó là mất ngưng kết. Khi hồng cầu đã mất hết thụ thể (kiểm tra bằng cách lấy 10 µl huyền dịch hồng cầu (đã khuấy đều), pha thêm PBS, quay ly tâm đổ nước mặt rồi thêm 100 µl PBS (huyền dịch sẽ là 1,5%) và kiểm tra đặc tính ngưng kết trong hai lỗ khay vi chuẩn độ với 2 đơn vị HA virus Lasota ở mỗi lỗ phản ứng (hồng cầu đạt yêu cầu chìm tự nhiên xuống tâm lỗ khay sau 15 - 30 phút). Quay li tâm với tốc độ 1.800 vòng/phút trong vòng 5 phút và rót bỏ nước mặt. Thêm PBS và lặp lại việc rửa hồng cầu bằng PBS ba lần. Sau khi loại bỏ PBS của lần rửa cuối cùng hồng cầu được pha thành huyền dịch 50% trong PBS pH 7,2. Kiểm tra phản ứng ngưng kết giữa hồng cầu đã Lasota hóa với kháng nguyên virus Newcastle bằng phản ứng HA thông thường trên một dãy lỗ khay. Hồng cầu đã xử lý đạt yêu cầu không còn tính gây ngưng kết với virus Lasota.
Xử lý hồng cầu bằng formalin: Để ổn định bề mặt hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 50% nói trên với một lượng tương đương dung dịch formalin 5% pH 7,2 (pha formalin 40% vào dung dịch PBS pH 7,2 theo tỷ lệ (1: 7) trong bình tam giác, đậy miệng bình và lắc đều thường xuyên ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó rửa huyễn dịch hồng cầu 3 lần trong PBS pH 7,2 hoặc nước sinh lý pH 7,2 rồi cân hồng cầu và pha thành huyễn dịch hồng cầu 3% trong PBS pH 7,2.
Tannin hóa hồng cầu: Pha huyễn dịch hồng cầu 3% với một lượng tương đương dung dịch tannin 1:20.000 lắc nhẹ thường xuyên để tăng sự tiếp xúc giữa các thành phần trong vòng 15 phút ở nhiệt độ phòng rồi rửa lại bằng dung dịch nước sinh lý pH 7,2 hai lần, lần thứ ba rửa bằng dung dịch PBS pH 6,4; cân xác định khối lượng hồng cầu rồi pha thành huyễn dịch hồng cầu 50% trong PBS pH 6,4. Chú ý sau khi xử lý tannin cần tránh cho hồng cầu tiếp xúc với dung dịch protein vì làm như vậy sẽ làm mất khả năng gắn kết hồng cầu với kháng nguyên qua cầu nối tannin.
Xử lý hồng cầu bằng virus: Virus hóa hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 50% đã được tannin hóa với một lượng tương đương virus Newcastle. (Lượng kháng nguyên này nếu quá thấp sẽ không gây ngưng kết chắc chắn với kháng thể, ngược lại nếu quá cao thì một mặt giá thành cao và mặt khác độ nhạy của phản ứng bị giảm do cần lượng kháng thể lớn để có ngưng kết vững chắc). Đậy nắp bình và lắc trộn đều trên đá lạnh trong 2 giờ để kháng nguyên kết bám trên bề mặt hồng cầu đã tannin hóa. Sau đó rửa lại bằng PBS pH 7,2 kết hợp quay ly tâm 3 lần, cân xác định khối lượng hồng cầu rồi pha thêm dung dịch PBS pH 7,2 để có huyễn dịch hồng cầu 1,5%. Đây là hồng cầu đã gắn kháng nguyên (HC-KN). Kiểm tra độ sa lắng của hồng cầu trong dung dịch PBS ở các lỗ khay vi chuẩn độ (microtitration plate) 96 lỗ. Hồng cầu kháng nguyên đạt tiêu chuẩn để làm phản ứng là hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết giả (hồng cầu không chìm xuống đáy lỗ khay sau 5 giờ) và có hiệu giá phản ứng từ 4log2
trở lên.
Lưu ý: Trong quá trình bảo quản hồng cầu kháng nguyên cần thêm một lượng formalin để đạt nồng độ formaldehyde 4/1000 để chống nhiễm khuẩn, nấm và có thể bảo quản tủ lạnh (1 - 4 oC) được 4 tháng.
Để tăng cường hiệu quả bảo quản hồng cầu kháng nguyên với mục đích sử dụng được trong thời gian dài, ta pha hồng cầu với dung dịch chống đông theo tỷ lệ 1: 2, sau đó cho vào bảo quản ở -20 oC. Nhờ có chất chống đông mà ở nhiệt độ đó hồng cầu vẫn không bị hủy. Vì vậy có thể bảo quản hồng cầu trong thời gian lâu hơn (trên 1 năm).
3.4 Các phản ứng tiến hành
3.4.1 Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA)
Thực hiện với hồng cầu gắn kháng nguyên để phát hiện kháng thể. Để phát hiện kháng thể, người ta gắn kháng nguyên lên nền mượn. Khi kháng
nguyên gặp kháng thể đặc hiệu lúc này sẽ xuất hiện hiện tượng ngưng kết [34]. Phản ứng tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ đáy chữ U. Để xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu virut Newcastle trong huyết thanh gà mỗi dãy 12 lỗ được sử dụng cho một phản ứng.
Đầu tiên cho vào tất cả các lỗ 50 µl dung dịch sinh lý NaCl (pH 7,2), sau đó cho vào lỗ thứ nhất 50 µl huyết thanh cần kiểm. Trộn đều bằng cách hút nhả 5 - 6 lần rồi hút qua lỗ thứ hai, thứ ba và tiếp tục các thao tác cho đến lỗ thứ 10 thì hút bỏ 50 µl. Thêm vào tất cả các lỗ 50 µl hồng cầu gắn kháng nguyên 1,5%. Huyễn dịch hồng cầu gắn kháng nguyên này được khuấy thường xuyên trên máy khuấy từ tính nhằm tránh sự sa lắng hồng cầu để có huyễn dịch hồng cầu đồng nhất cho tất cả các lỗ khay thí nghiệm. Đậy kín khay để tránh bị khô, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 - 4 giờ.
Lỗ thứ 11 và 12 chọn làm lỗ đối chứng âm và đối chứng dương
+ Đối chứng âm: Gồm dung dịch sinh lý (pH 7,2) và hồng cầu – kháng nguyên 1,5%
+ Đối chứng dương : Gồm kháng huyết thanh chuẩn, hồng cầu – kháng nguyên 1,5%
Đọc kết quả dựa vào lỗ đối chứng (đối chứng âm và dương) ở các lỗ thứ 11, 12.
+ Phản ứng âm tính hồng cầu lắng xuống tâm đáy, hình thành chấm tròn. + Phản ứng dương tính có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, hồng cầu chìm chậm với thời gian kéo dài thường trải đều trên đáy khay, tạo thành lớp nhăn nheo, tạo thành vòng có đường kính lớn hơn 3/4 đường kính lỗ khay.
Bảng 3.1. Các bước tiến hành làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà gián tiếp (IHA)
Nguyên liệu Lỗ số1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Nước sinh lý (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Kháng huyết thanh cần kiểm(µl) 50
Trộn và chuyển 50 µl từ lỗ thứ nhất sang lỗ kế tiếp bên phải. Hút bỏ 50 µl khỏi lỗ 10 sau khi trộn xong. Lỗ 11,12 là hai lỗ đối chứng âm và đối chứng dương
- 50 HC-KN 1,5%
3.4.2 Phản ứng xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (SSIA) 3.4.2.1 Nguyên lý phản ứng:
Với nguyên lý của phản ứng, nếu có sẵn kháng thể chuẩn (γ-globulin) kháng Newcastle, chúng ta có thể thiết lập phản ứng ngưng kết (gián tiếp) ổn định với kháng nguyên IHA. Khi đó nếu cho kháng thể đó tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa virus Newcastle rồi sau đó cho tiếp xúc với kháng nguyên IHA thì hiệu giá ngưng kết của kháng thể chuẩn sẽ giảm do một lượng kháng thể đã tham gia phản ứng với kháng nguyên bệnh phẩm và trở nên không tự do để tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA. Như vậy, ta có thể sử dụng cặp kháng nguyên IHA và kháng thể chuẩn (kháng huyết thanh hay γ-globulin kháng Newcastle) để phát hiện kháng nguyên virus Newcastle. Ngược lại, nếu trong bệnh phẩm có kháng thể với lượng đủ lớn thì kháng thể này sẽ cộng hợp với kháng thể chuẩn và làm tăng hiệu giá kháng thể khi tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA. Do virus Newcastle bài xuất phân và kháng thể niêm mạc
H C H C H C H C H C H C H C H C Hồng cầu gắn kháng nguyên Kháng thể (huyết thanh cần kiểm hoặc đối chứng dương) Kháng thể kết hợp kháng nguyên Bước 2: HC H C HC HC Hồng cầu gắn kháng nguyên Hồng cầu Hồng cầu đã tanin hóa Acid tanic Kháng nguyên Bước 1:
tham gia đáp ứng miễn dịch chống Newcastle, nên phân và niêm mạc trực tràng là bệnh phẩm thích hợp, cho tiếp xúc trước với kháng thể chuẩn trước khi tiếp xúc với hồng cầu kháng nguyên và phản ứng có thể bị ngăn trở hoặc được tăng cường nếu trong dịch bệnh phẩm có chứa kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng, hay có sự xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn [31].
3.4.2.2 Pha kháng huyết thanh chuẩn
Việc xác định hiệu giá kháng huyết thanh chuẩn bằng IHA là cần thiết để tiến hành phản ứng SSIA.
Để tiến hành phản ứng SSIA, chúng tôi cần một lượng kháng huyết thanh chuẩn có hiệu giá không đổi 4log2 để xử lý hết các mẫu.
Dựa trên nguyên tắc là cơ thể chỉ tạo được kháng thể khi có kháng nguyên gây bệnh (có thể là vaccin hoặc do cảm nhiễm tự nhiên từ môi trường), do kháng nguyên hồng cầu gắn virus đặc hiệu đã biết (virus vaccine Lasota) nên kháng thể hỗn hợp vẫn có thể cho kết quả đặc hiệu. Nếu sử dụng kháng thể hỗn hợp sẽ giảm chi phí cho phản ứng, vì vậy trong đề tài này kháng huyết thanh gà đạt hiệu giá cao khi kiểm tra IHA được sử dụng để làm kháng huyết thanh chuẩn.
Tiến hành:
Máu sau khi được lấy ở lò mổ về thì dùng pipet để hút phần kháng huyết thanh ở trên bề mặt vào các ống Eppendorf, sau đó cho các ống nghiệm vào trong tủ lạnh để trong vòng 5-7 giờ thì tận thu huyết thanh lần nữa.
Tiến hành dùng phản ứng IHA để kiểm tra hiệu giá của huyết thanh, với những huyết thanh đạt hiệu giá 4log2, 5log2, 6log2, 7log2, 8log2 thì được giữ lại và pha với nước sinh lý để đưa về hiệu giá chuẩn 4log2 theo các tỉ lệ sau:
+ Với kháng huyết thanh đạt hiệu giá 4log2 thì giữ nguyên . + Với kháng huyết thanh đạt hiệu giá 5log2 thì pha theo tỉ lệ 1:1 + Với kháng huyết thanh đạt hiệu giá 6log2 thì pha theo tỉ lệ 1:3 + Với kháng huyết thanh đạt hiệu giá 7log2 thì pha theo tỉ lệ 1:7 + Với kháng huyết thanh đạt hiệu giá 8log2 thì pha theo tỉ lệ 1:15
Kháng huyết thanh sau khi đã được pha về hiệu giá chuẩn 4log2 sẽ được cho vào các ống Eppendorf và được bảo quản ở -20 oC.
3.4.2.3 Tiến hành phản ứng:
Phản ứng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ, đáy chữ U. Ta đặt khay nằm dọc, được 12 dãy lỗ, mỗi dãy có 8 lỗ. Trên mỗi khay có 11 mẫu
cần kiểm được thực hiện kèm theo một mẫu chuẩn làm đối chứng. Ghi số thứ tự các lỗ từ 1 đến 8 trên đầu khay.
Các dãy mẫu kiểm ta tiến hành các bước như sau:
Bước 1. Dùng pipet cho vào lỗ số 2 đến số 8 của mỗi dãy, mỗi lỗ 50 µl nước sinh lý (để trống lỗ thứ nhất).
Bước 2. Cho vào lỗ thứ nhất của các dãy 50 µl dịch chiết mẫu bệnh phẩm (phân), mỗi lỗ đầu dãy chứa một mẫu (ghi số mẫu ở đầu mỗi dãy).
Bước 3. Hút 50 µl kháng huyết thanh chuẩn 4log2 cho vào lỗ thứ nhất của mỗi dãy. Dùng pipet trộn và hút 50 µl chuyển từ lỗ thứ nhất sang lỗ thứ hai, rồi lỗ thứ ba và tiếp tục trộn chuyển đến lỗ số 8 thì hút bỏ 50 µl.
Bước 4. Cho vào tất cả các lỗ 50 µl huyền dịch hồng cầu gắn kháng nguyên Newcastle 1,5%.
Đối chứng âm (phản ứng chuẩn) được thực hiện ở dãy cuối cùng của mỗi khay, gồm các bước như sau:
+ Cho vào tất cả các lỗ khay của dãy làm đối chứng 50 µl nước sinh lý. + Nhỏ vào lỗ thứ nhất 50 µl huyết thanh chuẩn đã biết hiệu giá 4log2, hút trộn và chuyển 50 µl sang lỗ thứ 2, rồi lỗ thứ 3 và tiếp tục trộn chuyển như vậy cho đến hết dãy thì hút bỏ 50 µl.
Nhỏ vào tất cả các lỗ 50 µl huyền dịch 1,5% hồng cầu gắn kháng nguyên Newcastle.
Đậy nắp khay, để ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút đến 4 giờ, kiểm tra kết quả khi phản ứng ngưng kết hồng cầu của dãy đối chứng âm biểu hiện rõ.
Đọc kết quả:
+ Phản ứng âm tính: không có sự xê lệch lỗ ngưng kết cuối cùng so với dãy đối chứng (lỗ số 4 là lỗ cuối cùng có ngưng kết).
+ Phản ứng dương tính: có sự xê lệch lỗ ngưng kết cuối cùng sang trái (ngưng kết cuối cùng ở các lỗ 3, 2 hoặc 1) so với dãy đối chứng.
Bảng 3.2. Sơ đồ phản ứng Trắc nghiệm xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (SSIA)
Nguyên liệu Lỗ số 1 2 3 4 5 6 7 8 Nước sinh lý (µl) 50 50 50 50 50 50 50 Dịch phân (µl) 50 Kháng huyết thanh chuẩn 4log2 (µl) 50
Trộn và chuyển 50 µl từ một lỗ sang lỗ kế tiếp bên phải. Cứ thế đến lỗ số 10 thì hút bỏ 50 µl sau khi trộn xong
Hình 3.3. Phản ứng Trắc nghiệm xê lệch ngưng kết gián
2.̀̀5 Phương pháp xử lý số liệu
-Tỷ lệ nhiễm bệnh
Tỷ lệ nhiễm bệnh (tỷ lệ dương tính) (%) = Số mẫu dương tính *100 Tổng số mẫu xét nghiệm
- Giá trị hiệu giá trung bình nhân: GMT=(T1. T2.T3....Tn)1/n
Với :
T1, T2, T3,...Tn là hiệu giá kháng nguyên của các mẫu bệnh phẩm xét nghiệm, n là số mẫu.
GMT: là giá trị trung bình nhân. Khi tính GMT, để tránh kết quả bằng không (0) do có ít nhất một mẫu âm tính, trước hết là vận dụng giá trị logarit hóa theo cơ số 2 như bội số pha loãng mẫu.
Log2GMT = (Log2T1 + log2T2 +log2Tn)/n Sau đó chuyển thành GMT=2(Log2GMT) [27] - Tỷ lệ bảo hộ:
Đối với bệnh Newcastle thì tỉ lệ gà có kháng thể bảo hộ phải đạt từ 70% trở lên [12].