2.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB)
2.3.1. Nhu cầu tìm kiếm các nguồn mới
Trong những năm gần đây, khả năng kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn khá phổ biến trong điều trị bệnh của con người và động vật. Vì thế sự tiếp tục tìm ra những chất kháng vi khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực thuốc. Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng của một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh. Trong số đó, việc sản xuất lactase từ vi khuẩn lactic đã thu hút nhiều sự chú ý do LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm.
2.3.2. Phương pháp tìm kiếm các nguồn mới
Tuy hầu hết các sản phẩm về lactase trên thị trường đều giống nhau về thành phần vi sinh, chỉ khác nhau về nhà sản xuất, mà mỗi chủng lại có phổ tác dụng khác nhau. Vì vậy việc phân lập để tuyển chọn ra những chủng, giống mới sẽ góp phần làm phong phú thêm nguồn lactase, làm tăng khả năng phòng và trị bệnh cho người và động vật. Viêc lựa chọn và phân lập các chủng vi khuẩn sản xuất lactase là một quy trình lựa chọn cẩn thận.
Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt… cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của vi khuẩn lactic đã trở nên được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,...
có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các chủng vi khuẩn lactic thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúp kích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên, đồng thời vì chúng có nguồn gốc từ thực phẩm nên đa số là đảm bảo về mặt an toàn cho con người và vật nuôi.
Vi khuẩn lactic được phân lập trên môi trường chuyên biệt MRS (DeMan Rogosa Sharpe, 1960) từ nhiều nguồn khác nhau:
29
- Từ các sản phẩm thực phẩm lên men như: kefir, sữa chua, dưa chua, nem chua, kim chi….
- Từ phân của các gia cầm: thỏ, gà, heo và từ mề gà…
- Từ sữa mẹ, phân trẻ sơ sinh….
Một chủng vi khuẩn sau khi đã được tuyển chọn, tạo dòng thuần thì việc quan trọng kế tiếp là phải xác định chúng thuộc giống nào, loài nào. Vì vậy, các phương pháp định danh được áp dụng.
Công việc tuyển chọn ngoài việc tìm ra chủng đảm bảo những thuộc tính đặc biệt của chúng, đảm bảo sự ổn định và độ thuần khiết cao và từ đó lự chon chủng có hoạt lực cao nhất theo từng mục đích sử dụng, từng đối tượng cho phù hợp. Khảo sát tính an toàn của chủng (đối với con người, cho động vật và môi trường) trước khi mang đi sử dụng.
2.3.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật
2.3.3.1. Định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống.
Ban đầu “vi khuẩn lactic” được dùng để chỉ các vi khuẩn làm chua sữa và sau đó một dạng vi khuẩn thuần khiết cũng được cho là vi khuẩn lactic (có thể là Lactococcus lactic) được đưa ra bởi J. Lister vào năm 1873. Một bước quan trọng trong phân loại vi khuẩn lactic được hình thành khi có sự giống nhau giữa các vi khuẩn trong sữa chua và các vi khuẩn tạo axit lactic khác có trong các nguồn khác nhau. Tuy nhiên vẫn còn nhiều nhầm lẫn khi chuyên khảo của Orla-Jensen xuất hiện (Orla-Jensen. 1919) và nó có ảnh hưởng lớn đến hệ thống phân loại của LAB, mặc dù đã có sự sửa đổi dáng kể nhưng cơ sở cho việc phân loại vẫn không thay đổi, Orla- Jensen vẫn phân loại dựa trên phương pháp cổ điển như: so sánh hình thái vi khuẩn (cocci, rod hoặc dạng tetrad), hình thức lên men glucose (đồng hình, dị hình), khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau (10oC và 45oC), khả năng lên men các nguồn đường khác nhau. Năm 1985 có thêm nhiều giống LAB mới được mô tả, tuy nhiên việc phân tích theo phương pháp truyền thống dựa vào hình thái vi khuẩn vẫn giữ vai trò quan trọng trong phân loại LAB.
30
Các giống LAB cũng đã được mô tả lại trong Bergey’s manual 1986, đây được xem như là phiên bản cuối cùng và chủ yếu tiếp tục phản ánh kết quả của Orla-Jensen 1919. Trong đó có sự phù hợp với các mô tả chung của các giống LAB điển hình:
Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Sự thay đổi chính trong Bergey’s manual 1986 là giống Streptococcus lần đầu tiên được chia thành 3 nhóm: Enterococcus, Lactococcus và Streptococcus sensu stricto (Schleifer.
1987). Một vài giống LAB giống với Lactococci được đề nghị xếp vào giống Vagococcus, các giống Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus không có thay đổi nhiều, tuy nhiên một vài loài trong Lactobacills được xếp vào giống Carnobacterium, và loài Pediococcus halophilus được đưa lên cấp giống là Tetragenococcus, một số LAB lên men dị hình trong Lactobacillus và Leuconostoc được xếp vào giống Weissella, ngoài ra một số giống mới cũng được mô tả có liên quan nhiều đến LAB như Alloiococcus, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcococcus, Ignavigranum và Lactosphaera…Bản sửa đổi được thực hiện vào năm 1986 cũng đã hỗ trợ nhiều trong việc phân loại vi sinh vật dựa trên thành phần hóa học và di truyền.
(Owen R. Fennema et al. 2004)
2.3.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống
Như đã đề cập, cơ sở chung cho việc phân loại LAB vào các giống khác nhau chủ bằng phương pháp định danh truyền thống và so sánh với khóa phân loại của Bergey’s manual 1986, tuy nhiên việc này ngày càng gặp khó khăn để đạt kết quả tin cậy khi phân loại một số giống mới nhưng nó lại là bước quan trọng trước khi tiến hành các phân tích sâu hơn.
LAB được phân chia theo hình thái như sau: dạng trực khuẩn (rod) gồm Lactobacillus và Carnobacterium; dạng cầu khuẩn gồm tất cả các giống còn lại và một ngoại lệ là đối với giống Weissella được mô tả gồm cả dạng trực khuẩn và cầu khuẩn; thêm vào đó, sự phân chia tế bào theo hai hướng vuông góc trên cùng một mặt phẳng dẫn đến sự hình thành dạng tứ cầu khuẩn (tetrad) và nó cũng được sử dụng để mô tả một dạng khác của cầu khuẩn, bao gồm các giống Aerococcus, Pediococcus và Tetragenococcus.
31
Phân chia theo hình thức lên men glucose, LAB được chia vào 2 nhóm: lên men đồng hình chuyển hóa glucose chủ yếu thành axit lactic và lên men dị hình tạo axit lactic, ethanol, axit acetic và CO2.Trong thực nghiệm, kiểm tra sự sinh khí CO2
để phân biệt giữa 2 nhóm: nhóm (Sharpe. 1979) Leuconostoc, Oenococci, Weissella và phân nhóm của Lactobacilli là lên men dị hình, tất cả các LAB khác là lên men đồng hình.
Sự phát triển ở các nhiệt độ khác nhau cũng góp phần phân biệt một số giống thuộc cầu khuẩn: Enterococci phát triển ở 10oC và 45oC, Lactococci và Vagococci phát triển được ở 10oC nhưng không thể sống ở 45oC, Streptococci thường không phát triển ở 10oC trong khi lại có thể phát triển ở 45oC tùy vào loài. Sự chịu muối (6,5% NaCl) cũng được sử dụng để phân biệt giữa Enterococci và Lactococi, Vagococci và Streptococci (Mundt. 1986). Đặc biệt khả năng chịu muối (18% NaCl) được giới hạn trong Tetragenococcus. Khả năng chịu axit ở kiềm cũng rất hữu ích trong việc phân loại. Aerococci, Carnobacteria, Enterococci, Tetragenococci và Vagococcicos thể phát triển ở pH cao những không phát triển ở pH = 9.6.
Ngoài ra sự hình thành các dạng đồng phân của axit lactic trong quá trình len men glucose cũng được sử dụng trong phân biệt giữa Leuconostocs (chỉ tạo D-lactic axit) và Lactobacilli lên men dị hình (tạo axit lactic cả 2 dạng D và L). Tuy nhiên Weissella có thể gây nhầm lẫn trong vấn đề này.
(Owen R. Fennema et al. 2004) a. Dựa trên đặc điểm hình thái:
- Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến).
- Kiểm tra khả năng di động: nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi trường thạch mềm.
- Nhuộm bào tử: nhuộm lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton), nhuộm Carbolic Fuchsin.
- Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo và phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet).
- Nhuộm vi khuẩn kháng axit…
32
b. Dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý:
- Hình thái khuẩn lạc.
- Nhiệt độ sinh trưởng, chịu axit, chịu muối mật…
- Nhu cầu oxygen.
c. Dựa trên các phản ứng sinh hóa:
Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định danh cho phù hợp như: khả năng đồng hóa các nguồn carbon, khả năng đồng hóa các nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza, xét nghiệm catalase, khả năng lên men/oxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứng Methyl - Methyl Red, phản ứng V.P. (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza…
Ngoài ra còn một số dựa trên phản ứng sinh hóa chuyên biệt hơn như:
+ API20E KIT : dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân: trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến làm sai kết quả.
+ Phân biệt bằng thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác
33
nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.
+ Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng có hạn chế là: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại.
+ Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin.
2.3.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại
Việc phân loại LAB chủ yếu dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa.
Tuy nhiên trong thực nghiệm, các đặc điểm này không đủ để định danh chính xác một chủng đến cấp loài cụ thể. Ngày nay với công nghệ xác định trình tự DNA một cách tự động và nhanh chóng, người ta đã trực tiếp xác định được trình tự của gen mã hóa cho 16S rRNA và tạo phương tiện dễ dàng cho phân loại vi khuẩn (Owen R.
Fennema et al. 2004)
Việc xác định trình tự của gen 16S rRNA để phân tích sự phát sinh loài của LAB đã được thực hiện vào những năm 1990, bắt đầu từ sự phát triển các đầu dò DNA để định danh vi khuẩn. Việc phân loại LAB bằng các đầu dò 16S hoặc 23S RNA đã được phát triển và sử dụng đối với Lactococci, Enterococci, Lactobacilli, Carnobacteria và phân biệt Vagococci với các LAB khác…Dữ liệu về trình tự các gen 16S rRNA của LAB đã được tích lũy trong suốt nhiều năm qua và danh mục các đầu dò hiện có được đưa ra bởi Pot et al,.1994.
34