VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.4. Phương pháp thí nghiệm
3.4.3. Phương pháp định danh vi khuẩn lactic
3.4.3.9. Sàng lọc hoạt tính lactase
Mục đích: sàng lọc và chọn ra những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lactase.
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính của enzyme -galactosidase (U) là tổng lượng enzyme xúc tác chuyển hóa ONPG thành 1 mol ONP trên 1 ml canh trường trong 1 phút ở 370C.
Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi là hoạt độ) của enzyme. Trong phản ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Để xác định hoạt độ của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học. Các phương pháp: so màu, đo khí, đo độ phân cực,
51
đo độ nhớt, chuẩn độ, quang phổ kế, sắc kí, phóng xạ, đo huỳnh quang... được dùng phổ biến trong nghiên cứu định lượng các phản ứng enzyme.
Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:
1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định.
3. Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Đơn vị hoạt độ enzyme:
Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1àmol) cơ chất sau một phỳt ở điều kiện tiờu chuẩn.
1 U = 1àmol cơ chất (10-6mol)/ phỳt.
Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 Kat = 1 mol cơ chất/giõy = 60 mol/phỳt = 60 x 106 àmol/phỳt = 6 x 107 U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanoKatal)
Trong bài luận văn này, ta xác định hoạt độ enzyme lactase bằng phương pháp đo huỳnh quang với cơ chất ONPG.
Nguyên tắc: ONPG (O-nitrophenyl-β-D-glucoside) là hợp chất không màu có công thức hóa học gần giống lactose. Khi trong môi trường có sự hiện diện của β- galactosidase sẽ xảy ra quá trình thủy phân ONPG tạo galactose và Ortho-nitrophenol có màu vàng, được đo ở bước sóng 420 nm, cường độ của màu sắc tỷ lệ với nồng độ enzyme.
Tiến hành: Khảo sát hoạt tính β-galactosidase Dựng đường chuẩn ONP
52
0,001M ONP: Hòa tan 139,1mg ONP vào 50ml ethanol, định mức đến 1000ml nước.
Hút 10,0ml nồng độ 0,001M ONP định mức lên 100ml như vậy 1ml dung dịch ONP này chứa 0,1mol ONP
Nước cất (ml) 10 8,0 6,0 4,0 2,0 0
ONP(ml) 0 2,0 4,0 6,0 8,0 10
Na2CO3 10% (ml) 1 1 1 1 1 1
Hàm lượng ONP (àmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Đo ở bước sóng 420nm.
Xác định hoạt tính:
Cấy 7% giống vào môi trường MRS đã ủ 370C, 24 giờ.
Thu dịch nuôi cấy, lắc đều, lấy X ml dịch nuôi cấy đem đồng nhất với áp suất 2000pisg. Sau đó ly tâm 10000/ phút trong 20 phút, thu dịch nổi để xác định hoạt tính enzyme.
Qui trình xác định hoạt tính lactase
Thử thật Thử không
ONPG 0.2 ml Enzyme 1 ml
Enzyme 1 ml Na2 CO3 1ml
500C, 10 phút
Na2 CO3 1ml ONPG 0.2 ml
Đo OD ở bước song 420nm ΔOD= ODtt-ODtk
`
Công thức xác định hoạt tính lactase (U/ml) .2, 2.
11. .10 a n H X
a: hàm lượng ONP suy ra từ đường chuẩn (àmol) X: thể tích canh trường (ml)
n: số lần pha loãng.
(U/ml)
53
ONPG (ortho-Nitrophenyl-β-galactoside) là một cơ chất dùng để xác định hoạt tính của enzyme lactase. Hợp chất này bình thường không màu. Tuy nhiên dưới tác dụng của enzyme lactase, ONPG sẽ được chuyển hóa thành ONP (ortho-nitrophenol) và galactose. Hợp chất màu vàng này có thể được hấp thụ ở bước sóng 420nm. Vì vậy, để khảo sát được hoạt tính của lactase chúng tôi tiến hành xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD và hàm lượng ONP (Phụ lục 4)