Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp thí nghiệm
3.5.3. Bố trí thí nghiệm
3.5.3.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu
Trước khi tiến hành thực hiện thí nghiệm nghiên cứu khả năng khử trùng mẫu của nồng độ và thời gian xử lý hỗn hợp nano. Chúng tôi thực hiện các bước sau:
B1. Rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy cho sạch bụi đất.
B2. Đưa mẫu vào phòng nuôi và rửa lại bằng nước cất vô trùng thêm 2-3 lần nữa.
B3. Cho mẫu vào box cấy, đổ ngập cồn 70o trong 1 phút.
B5. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần cho sạch cồn.
Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp
Khử trùng mẫu với các công thức khác nhau:
- CT1: javen thương mại 5% lắc mẫu trong vòng 5 phút (đối chứng).
- CT2: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 100 ppm.
- CT3: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 150 ppm.
- CT4: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 200 ppm.
- CT5: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 250 ppm.
(CT2, CT3,CT4, CT5 thực hiện trong 1 giờ, cú 15 phút lắc một lần).
Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần nuôi cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần tiên tiếp, mỗi công thức thí nghiệm 20 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống.
Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp.
Sử dụng nồng độ hỗn hợp nano tốt nhất ở thí nghiệm 1.1 và xử lý ở 5 thời gian khác nhau là (30, 45, 60, 75, 90 phút) tương ứng với 5 công thức.
Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần nuôi cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần liên tiếp, mỗi công thức thí nghiệm 20 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống.
3.5.3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.
Đoạn thân mang mắt ngủ sau khi được khử trùng ở nồng độ và thời gian hỗn hợp nano bạc -đồng thích hợp nhất ở thí nghiệm (3.5.3.1.) được dùng để tái sinh chồi.
Chất điều tiết sinh trưởng BA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với 5 công thức tương ứng như sau:
CT1: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA.
CT2: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 1,0 mg/l BA.
CT3: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 1,5 mg/l BA.
CT4: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 2,0 mg/l BA.
CT5: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 2,5 mg/l BA.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Mẫu được đánh giá sau 2, 3,4 tuần trên môi trường nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.
Sau khi xử lý số liệu thu được sẽ tìm được công thức với nồng độ BA thích hợp nhất (M1) cho sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ.
Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.
Sau khi tìm được môi trường có nồng độ BA thích hợp nhất cho bật chồi hoa hồng Pháp là M1, chúng tôi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc được bổ sung vào môi trường M1 đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ với các nồng độ nano bạc tương ứng như sau:
CT1: M1 + 0 ppm NS.
CT2: M1 + 2 ppm NS.
CT3: M1 + 4 ppm NS.
CT4: M1 + 6 ppm NS.
CT5: M1 + 8 ppm NS.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Mẫu được đánh giá sau 2, 3, 4 tuần trên môi trường nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.
3.5.3.3.. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA và nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng hình thành mô sẹo của mẫu lá cây hoa hồng in vitro, lá mầm in vitro có kích thước khoảng 0,5 cm-1,5 cm được cắt bỏ răng cưa và tạo vết thương được đưa vào môi trường tạo callus được bố trí với 5 nồng độ IBA khác nhau tương ứng 5 CT như sau:
CT1: MS + 30g/l sucrose + 0,0 mg/l IBA.
CT2: MS + 30g/l sucrose + 0,1 mg/l IBA.
CT3: MS + 30g/l sucrose + 0,3 mg/l IBA.
CT4: MS + 30g/l sucrose + 0,5 mg/l IBA.
CT5: MS + 30g/l sucrose + 0,7 mg/l IBA.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu tạo callus.
Sau khi có kết quả, chúng tôi tìm ra công thức phù hợp nhất (M2) cho quá trình tạo mô sẹo từ lá in vitro.
Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.
Sau khi tìm được môi trường bổ sung BA phù hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp là M2, chúng tôi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào môi trường M2 đến quá trình tạo mô sẹo với các nồng độ nano như sau:
CT1: M2 + 0 ppm NS.
CT2: M2 + 2 ppm NS.
CT3: M2 + 4 ppm NS.
CT4: M2 + 6 ppm NS.
CT5: M2 + 8 ppm NS.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ tạo callus.
3.5.3.4. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.
Chồi được bật ra từ mắt ngủ có chiều dài khoảng 1,5 - 2,0 cm, số lá là 3–4 lá được cắt ra và nuôi trong môi trường tái sinh chồi in vitro có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:
CT1: MS + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA.
CT2: MS + 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l BA.
CT3: MS + 30 g/l sucrose + 1,0 mg/l BA.
CT4: MS + 30 g/l sucrose + 1,5 mg/l BA.
CT5: MS + 30 g/l sucrose + 2,0 mg/l BA.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá mẫu sau 2, 3, 4, 5, 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy để xác định các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.
Sau khi xử lý số liệu, chúng tôi tìm được ra công thức thích hợp nhất (M3) cho quá trình tái sinh chồi in vitro.
Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.
Sau khi tìm được môi trường bổ sung BA thích hợp nhất cho quá trình
nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp là M3, em tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào môi trường M3 đến quá trình nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp với các nồng độ nano như sau:
CT1: M3 + 0 ppm NS.
CT2: M3 + 2 ppm NS.
CT3: M3 + 4 ppm NS.
CT4: M3 + 6 ppm NS.
CT5: M3 + 8 ppm NS.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá mẫu sau 2, 3, 4, 5, 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy để xác định các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.
3.5.3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp.
Chồi bật ra từ mắt ngủ được chuyển sang môi trường nhân nhanh, sau 6 tuần cắt các chồi chuyển sang nuôi trong môi trường ra rễ có bổ sung -NAA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:
CT1: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 0mg/l -NAA.
CT2: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 1mg/l -NAA.
CT3: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 2mg/l -NAA.
CT4: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 3mg/l -NAA.
CT5: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 4mg/l -NAA.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu theo dõi sự phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/chồi.
Sau khi xử lý kết quả thu được sẽ tìm được môi trường có nồng độ - NAA thích hợp nhất (M4) cho sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp
Sau khi tìm được môi trường có nồng độ -NAA thích hợp nhất, em tiếp tục bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc được bổ sung vào môi trường M4 tới sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp với các công thức như sau:
CT1: M4 + 0 ppm NS.
CT2: M4 + 2 ppm NS.
CT3: M4 + 4 ppm NS.
CT4: M4 + 6 ppm NS.
CT5: M4 + 8 ppm NS.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu theo dõi sư phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/chồi.