Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.3. Xác định hoạt tính của dịch chiết thô thảo dược trong phòng trị bệnh
Từ kết quả nghiên cứu được nêu ở mục 4.2 nêu trên, dịch chiết thô thồm lồm (M4) và thầu dầu (M5) được sử dụng trộn vào thức ăn cho tôm ăn trong 7 ngày trước khi công cường độc vi khuẩn V. parahaemolyticusKC12.020 bằng hình thức ngâm. M4 sử dụng 2 nồng độ: M4NĐ1=25g dịch thô/100kg tôm;
M4NĐ2=30g dịch chiết thô/100kg tôm và M5 sử dụng 2 nồng độ: M5NĐ1=35g dịch thô/100kg tôm; M5NĐ2=40g dịch thô/100kg tôm.
Kết quả được trình bày ở bảng 4.2, hình 4.3, hình 4.4.
Bảng 4.2. Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào thức ăn cho tôm ăn trong điều kiện phòng thí nghiệm
Dịch chiết thô
Nồng độ dịch chiết thô (g/100kg
tôm)
Kết quả
Thời gian chết
Tỷ lệ tôm sống trước khi
công cường độc (%)
Tỷ lệ tôm chết
sau 2 ngày công cường độc (%)
Tỷ lệ tôm sống sau
khi kết thúc thí nghiệm (%) M4 (Thồm lồm) 25 Ngày thứ 3-ngày thứ 9
Ngày thứ 3-ngày thứ 9 Ngày thứ 3-ngày thứ 9 Ngày thứ 3-ngày thứ 9
52,4 100 0
30 45,0 100 0
M5 (Thầu dầu) 35 32,5 100 0
40 15,0 100 0
ĐC (+) 0 Ngày thứ 7-ngày thứ 10 100 100 0
ĐC (-) 0 Ngày thứ 1-ngày thứ 14 100 0 100
Lô thí nghiệm tôm được ăn thức ăn có chứa dịch chiết thô M4 và M5 có hiện tượng tôm chết bắt đầu ở ngày thứ 3. Đến ngày thứ 7 số lượng tôm còn lại ở các bể M4NĐ1, M4NĐ2, M5NĐ1 và M5NĐ2 tương ứng lần lượt là 52,5; 45;
32,5 và 15%. Sau 2 ngày công cường độc 100% tôm chết (ngày thứ 9 của quá
trình thí nghiệm) (Bảng 4.2), tái phân tích vi khuẩn xác định sự có mặt tác nhân gây AHPND trong tôm thu từ lô thí nghiệm (Hình 4.4).
Bên cạnh đó, một số thông tin được ghi nhận trong quá trình thí nghiệm như sau: tôm thí nghiệm sử dụng thức ăn trộn dịch chiết thô có biểu hiện chết ở ngày thứ 3, tôm chết trong ruột không có thức ăn, một số tôm lột xác đã bị các cá thể tôm cùng đàn ăn thịt. Sau mỗi ngày trước khi ăn đáy bể được xi phông thu được nhiều thức ăn thừa (ở bể M4NĐ1, M4NĐ2, M5NĐ1 và M5NĐ2). Trong khi đó lô đối chứng không có các dấu hiệu này, (ruột tôm đầy thức ăn, tôm phản xạ nhanh đồng thời xi phông đáy bể không có thức ăn, chỉ có phân tôm).
Lô đối chứng dương tôm chết 100% sau 3 ngày công cường độc, 05 mẫu tôm thu tái phân tích vi khuẩn cho kết quả 100% dương tính AHPND bằng phương pháp PCR . Như vậy có thể thấy lô thí nghiệm ăn thảo dược tôm chết nhanh hơn sau khi công cường độc (2 ngày) so với lô đối chứng dương (3 ngày).
Như vậy có thể thấy, tôm chết ở lô M4NĐ1, M4NĐ2, M5NĐ1 và M5NĐ2 bởi tôm đói và ăn thịt lẫn nhau trong 7 ngày đầu thí nghiệm. Ngày thứ 8 trở đi tôm chết nhanh do đói và nhiễm vi khuẩn gây bệnh AHPND.
Hình 4.3. Tỷ lệ tôm chết khi cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thô M4 và M5 (%)
Hình 4.4. Mẫu phân tích sau khi công cường độc vi khuẩn gây bệnh AHPND lên tôm thí nghiệm (1,2, và 3 là mẫu thu thuộc lô sử dụng thảo dược M4, 4,5 và 6 mẫu thu thuộc lô sử dụng thảo dược M5, 7 và 8 thuộc lô đối chứng âm) Sau khi có kết quả kiểm tra kháng sinh đồ đối với dịch chiết thô thồm lồm, thí nghiệm trên tôm nuôi được triển khai bằng hình thức cho ăn và ngâm trong quy mô phòng thí nghiệm. Đối với hình thức cho ăn, hiện tượng tôm chết bắt đầu ở ngày thứ 3, tỷ lệ tôm chết tăng dần theo thời gian từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7, tỷ lệ chết không có sự sai khác ý nghĩa (p > 0,05) giữa nồng độ 25 g/100kg tôm và 30 g/100 kg tôm. Một số biểu hiện của tôm trong bể cho ăn thảo dược được ghi nhận như sau: Số tôm chết trong ruột không có thức ăn, một số tôm lột xác đã bị các cá thể tôm cùng đàn ăn thịt. Sau mỗi ngày trước khi ăn, đáy bể được xi phông thu được nhiều thức ăn thừa. Trong khi đó ở lô đối chứng dương và âm, ruột tôm đầy thức ăn, tôm phản xạ nhanh, đồng thời xi phông đáy bể không có thức ăn, chỉ có phân tôm. Sau khi công cường độc, tôm được cho ăn thức ăn chứa thảo dược chết (100%) sau 1 ngày, trong khi đó lô đối chứng dương chết (100%) ở ngày thứ 3. Qua đây nhận thấy, tôm không ăn mồi do dịch chiết thô thồm lồm có trong thức ăn, tôm chết do đói/ăn thịt lẫn nhau ở thời gian trước khi công cường độc, ngay sau khi công cường độc tôm chết nhanh hơn do chịu thêm ảnh hưởng của độc tố V. parahaemolyticus.
4.3.2. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào môi trường nước nuôi tôm
Dịch chiết thô thồm lồm và thầu dầu được sử dụng bổ sung vào môi trường nước tại 2 thời điểm (lần 1 tại thời điểm bắt đầu công cường độc và lần 2 cách lần 1 là 24h). Hình thức công cường độc vi khuẩn V. Parahaemolyticus KC12.020 lên tôm bằng hình thức ngâm. M4 sử dụng 2 nồng độ: Nồng độ thử nghiệm bao gồm M4NĐ1 (25g/m3); M4NĐ2 (30g/m3); M5NĐ1 (35g/m3) và M5NĐ2 (40g/m3).
Kết quả được trình bày ở bảng 4.3, bảng 4.4 và hình 4.5.
Bảng 4.3. Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào môi trường nước nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm
Dịch chiết thô
Nồng độ dịch chiết thô
(g/m3)
Kết quả
Thời gian chết
Tỷ lệ tôm chết khi công cường
độc (%)
Tỷ lệ tôm còn sống khi kết
thúc thí nghiệm (%)
M4 (Thồm lồm) 25 Ngày thứ 1-ngày thứ 6 100 0
30 Ngày thứ 1-ngày thứ 21 40,0 60,0
M5 (Thầu dầu) 35 Ngày thứ 1-ngày thứ 6 100 0
40 Ngày thứ 1-ngày thứ 6 100 0
ĐC (+) 0 Ngày thứ 1-ngày thứ 3 100 0
ĐC (-) 0 Ngày thứ 1-ngày thứ 21 0 100
Kết quả nghiên cứu thử nghiệm chỉ rõ, lô thí nghiệm sử dụng chiết phẩm M4 ở nồng độ 25g/m3; M5 ở nồng độ 35g/m3 và 40g/m3 có tỷ lệ tôm chết 100%
sau 6 ngày gây nhiễm, trong khi đó lô đối chứng dương tôm chết 100% sau 3 ngày công cường độc vi khuẩn gây AHPND (Bảng 4.3), 05 mẫu tôm thu tái phân tích vi khuẩn cho kết quả 100% dương tính AHPND bằng phương pháp PCR.
Như vậy thời gian tôm chết ở lô thí nghiệm sử dụng chiết phẩm thô chậm hơn so với lô đối chứng dương là 3 ngày. Điều đó có nghĩa dịch chiết đã có hiệu quả diệt vi khuẩn trong môi trường nước nhưng chưa hoàn toàn.
Kết quả nghiên cứu cũng chỉ rõ lô sử dụng chiết phẩm M4 với nồng độ 30g/m3, có tỷ lệ chết tích lũy đến ngày thứ 21 là 40%. Số tôm còn lại sau ngày thứ 21 được ghi nhận phản xạ nhanh, ăn tốt.
Hình 4.5. Tỷ lệ tôm chết khi bổ sung chế phẩm M4 và M5 vào nước (%)
Như vậy có thể thấy dịch chiết thô M4 ở nồng độ 30g/m3sử dụng pha vào nước nuôi tôm có mầm bệnh AHPND ở 2 thời điểm (bắt đầu xuất hiện mầm bệnh và lặp lại sau 24h) đã nâng cao tỷ lệ sống của tôm lên (60%) so với lô đối chứng dương. Dịch chiết thô M4 (25g/m3)và M5 (35g/m3; 40g/m3) không diệt vi khuẩn trong nước hoàn toàn, vì vậy tỷ lệ chết 100% sau 6 ngày thí nghiệm.
Hình 4.6. Thử nghiệm hiệu quả hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh AHPND trong phòng thí nghiệm ướt
Bảng 4.4. Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND trong quá trình thí nghiệm (khi sử dụng dịch chiết thô thân lá cây thồm lồm) (%)
TT
Ngày thí nghiệm
Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND (%)
Cho ăn Ngâm
Đc 25 g/100 âm
kg tôm
30 g/100 kg tôm
ĐC dương
25
g/m3 30 g/m3 ĐC dương
1 2(*) # # # 66,7 33,3 100 #
2 3 # # # 66,7 0 100 0
3 9 100 100 100 # # # 0
4 21 Kết thúc thí nghiệm ngày thứ 14 # 0 # 0
Ghi chú: #: Không thu mẫu phân tích. Số mẫu mỗi lần phân tích n =3 *: Thu mẫu trước khi bổ sung thảo dược lần 2
Ở lô thí nghiệm dịch chiết thô bổ sung vào nước tại 2 thời điểm (ngay khi công cường độc vi khuẩn và sau 24 h) với nồng độ sử dụng 25-30 g/m3 là hoàn toàn an toàn cho tôm nuôi (Manoj Kumar Das, 2015). Trong quá trình thí nghiệm, tôm được tái phân tích vi khuẩn gây bệnh AHPND bằng kỹ thuật PCR sau 1 ngày gây nhiễm, kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính với vi khuẩn gây bệnh AHPND đạt 33,3-100% (Bảng 4.4). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lai và ctv khi nhóm tác giả cho rằng, với hình thức gây nhiễm là ngâm tôm trong nước với mật độ V. parahaemolyticus 106 cfu/ml, sau 6 giờ gây nhiễm tôm
có kết quả dương tính với bệnh AHPND bằng kỹ thuật PCR. Đặc biệt, bằng kỹ thuật mô bệnh học đã xác định rõ biến đổi đặc trưng cơ bản của bệnh AHPND như các tế bào gan có nhân lớn bất thường và sự bong tróc tế bào (Lai et al., 2015). Sở dĩ, ở thí nghiệm bổ sung thảo dược 25-30 g/m3, tỷ lệ mẫu dương tính AHPND lần lượt tương ứng 66,7 và 33,3% thấp hơn so với lô đối chứng dương (100%) ( Bảng 4.4), nguyên nhân do dịch chiết thô thảo dược đã diệt, ức chế vi khuẩn phát triển, mật độ vi khuẩn trong nước không đạt mức 105-106 cfu/ml. Như vậy, với nồng độ dịch chiết thô thồm lồm 30 g/m3 bổ sung vào nước 2 lần đã có ý nghĩa quan trọng nâng cao tỷ lệ sống của tôm ở điều kiện tôm sống trong môi trường chứa tác nhân gây bệnh AHPND với mật độ 105-106 cfu/ml, tỷ lệ sống cộng dồn đến 21 ngày thí nghiệm là 60%, trong khi đó lô đối chứng dương tỷ lệ sống 0% ở ngày thứ 3 (Bảng 4.3). Hơn nữa, ở ngày cuối thí nghiệm tôm có kết quả âm tính với vi khuẩn gây bệnh AHPND.