Mẫu vật chứa vi-rút HAdV được lấy từ mẫu nước mắt của các bệnh nhân đau mắt đỏ tình nguyện tham gia nghiên cứu tại Bệnh viện mắt trung ương, Hà Nội. Mỗi mẫu vật của bệnh nhân được chứa trong các ống 1.5 ml riêng biệt và bảo quản ở điều kiện -20oC tại bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội cho tới khi được dùng để tách chiết ADN của vi-rút.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định sự có mặt của chủng HAdV-3
Chúng tôi đã sử dụng một mẫu bệnh phẩm có chứa ADN của vi-rút HAdV-3 để thực hiện luận văn này. Phương pháp để xác định sự có mặt của chủng HAdV-3 là dựa vào trình tự HVR-7 (hypervariable region - 7) của gen hexon đặc trưng cho từng chủng HAdV khác nhau. Quá trình thực hiện phương pháp này đã được tiến hành trước đó bởi một thành viên khác trong nhóm nghiên cứu [24].
2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho các gen Fiber, Penton và Hexon của HAdV-3 Đầu tiên, chúng tôi dùng phần mềm ClustalW để so sánh các trình tự hệ gen HAdV-3 đã được công bố và tìm ra hai vùng trình tự bảo thủ nằm gần kề 2 vùng biên trái và phải của mỗi đoạn ADN mã hóa cho protein tương ứng. Cặp mồi thứ nhất được thiết kế bắt cặp đặc hiệu trên hai vùng bảo thủ này. Sau đó, trình tự ADN giải được từ cặp mồi này được sử dụng để thiết kế cặp mồi thứ hai khuếch đại đặc hiệu đoạn ADN phía trong của từng gen. Tương tự, việc giải trình tự và thiết kế mồi được lặp lại cho tới khi chúng tôi thu được trình tự hoàn chỉnh của mỗi gen. Tất cả các mồi dùng trong nghiên cứu này được tổng hợp bởi công ty PHUSA Biochem, Cần Thơ, Việt Nam.
2.2.3. Kỹ thuật khuếch đại gen PCR
Để khuếch đại đặc hiệu các đoạn gen fiber, penton và hexon, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) với enzyme Phusion Hotstart II DNA
20
Polymerase của hãng Thermo Scientific sản phẩm enzyme này có hoạt tính đọc sửa tốt hơn Taq polymerase. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được thực hiện theo thông tin trong Bảng 3 và 4.
Bảng 3: Thành phẩn phản ứng PCR
Húa chất Nồng độ cuối cựng Thể tớch (àL)
Nước de-ion Đủ 50
Buffer GC 1X 10
Mồi 0.3 àM mỗi loại 1.5
dNTPs 200 àM mỗi loại 1
DMSO 3% 1.5
Khuôn 1
Polymerase 0.02 U/àL 0.5
Bảng 4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian (giây) Chu kỳ (lần lặp)
Khởi đầu 98 30 1
Biến tính 98 20
40
Gắn mồi * 10
Kéo dài 72 **
Kết thúc 72 300 1
Bảo quản 20 ∞
*: Tính bằng công cụ online của nhà sản xuất dựa theo phương pháp nhiệt động học của Allawi và SantaLucia [2].
**: Thời gian kéo dài được xác định từ tốc độ tổng hợp của enzyme là 30 giây/1 kb.
2.2.4. Kỹ thuật điện di trên gel Agarose
Sau khuếch đại PCR, 3 àL mỗi phản ứng cựng với marker tương ứng (1 kb hoặc 100 bp) được điện di trên gel agarose 1%. Sau điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch Ethidium Bromide nồng độ 0.5 àg/mL trong vũng 10 phỳt. Cuối cựng, bản
21
gel được quan sát trên ánh sáng UV ở bước sóng 260-280 nm và chụp ảnh bằng hệ thống Alphaimager MINI.
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR chuẩn bị cho giải trình tự
Những sản phẩm PCR đặc hiệu, đúng với kích thước lý thuyết của từng cặp mồi được chúng tôi tinh sạch bằng bộ sản phẩm MEGAquick-spinTM Total fragment DNA purification kit của hãng iNtRon, Hàn Quốc. Các thao tác được thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Mục đích của việc tinh sạch sản phẩm PCR là để loại bỏ những thành phần thừa như: DNA polymerase, dNTPs, mồi, các thành phần muối trong dung dịch đệm; tạo điều kiện cho phản ứng giải trình tự diễn ra tốt hơn và cho ra tín hiệu rõ ràng hơn.
2.2.6. Giải trình tự ADN
Sản phẩm PCR sau tinh sạch được gửi đi giải trình tự tại công ty 1stBASE Malaysia với các hóa chất của BigDye® Terminator v3.1 cycle sequencing kit.
2.2.7. Phân tích trình tự ADN và protein
Sau khi nhận kết quả từ công ty 1stBASE, chúng tôi xử lý tín hiệu giải trình tự ADN bằng phần mềm Bioedit [25] để loại bỏ những đoạn trình tự không thuộc phần mã hóa protein. Tiếp theo, trình tự ADN của từng gen được so sánh với trình tự tham chiếu HAdV-3 trên cơ sở dữ liệu NCBI, mã số NC_011203.1. Thông qua so sánh, chúng tôi đã tìm ra những sai khác ở mức độ ADN dẫn đến các biến đổi axit amin của từng protein fiber, penton và hexon. Sau đó, trình tự ADN được dịch thành trình tự axit amin bằng công cụ Snapgene, sử dụng cho việc xây dựng cấu trúc mô phỏng của từng protein.
2.2.8. Phân tích cấu trúc ba chiều của các protein
Sử dụng chương trình SWISS-MODEL kết hợp với cơ sở dữ liệu protein PDB và trình tự axit amin của protein fiber, penton và hexon của HAdV-3 ở Việt Nam, chúng tôi đã xây dựng được cấu trúc ba chiều mô phỏng của các protein. Sau đó, bằng phần mềm pyMOL, chúng tôi xác định được vị trí của những biến đổi axit amin của
22
từng protein trên cấu trúc ba chiều tương ứng. Cuối cùng, dựa trên vị trí và tính chất của những axit amin biến đổi, chúng tôi dự đoán những hậu quả liên quan tới sức sống, khả năng xâm nhiễm và độc lực của vi-rút HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam.
23