Chúng tôi đã thiết kế được 2 cặp mồi để khuếch đại đặc hiệu gen fiber. Trình tự mồi và kích thước sản phẩm khuếch đại gen fiber được trình bày chi tiết trong Bảng 5.
Bảng 5: Mồi khuếch đại gen fiber của HAdV-3 ở Việt Nam Tên
mồi Trình tự (chiều 5’-3’) Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp)
FF1 GGGTGGAATTCTCCCAATG
2818
FR1 TGAAACCCGAGCTTCTATGA
FF2 CTTCGAGACCTCCTACCCAT
1531
FR2 TTCGGATTATGATTCCCATCG
3.1.2. Kết quả khuếch đại PCR gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam
Hình 8 cho thấy băng sản phẩm PCR của cả 2 cặp mồi đều sáng bằng hoặc sáng hơn marker tương ứng, điều này cho thấy lượng sản phẩm khuếch đại đã đạt chuẩn. Vị trí của các băng cũng cho thấy kích thước các sản phẩm khuếch đại đều phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Bên cạnh đó, không quan sát thấy có vệt smear hoặc sản phẩm phụ nào, chứng tỏ sản phẩm khuếch đại rất đặc hiệu và đáng tin cậy. Như vậy, các sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp PCR mà chúng tôi thực hiện, đều đủ điều kiện để được tinh sạch trực tiếp, không cần phải thực hiện thôi gel để loại bỏ các sản phẩm không mong muốn. Sản phẩm ADN sau tinh sạch đã được gửi cho công ty 1stBASE để giải trình tự.
24
Hình 8: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen fiber 3.1.3. Kết quả giải trình tự gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam
Hình 9 cho thấy các đỉnh tín hiệu giải trình tự gen fiber đều rất rõ ràng và đạt độ phân giải cao. Tín hiệu nhiễu nền gần như không có. Tổng độ dài đã giải được từ 2 cặp mồi FF1-FR1 và FF2-FR2 là 2707 bp. Tuy nhiên, sau khi lược bỏ những trình tự không thuộc vùng mã hóa thì chiều dài gen fiber thu được là 960 bp. Như vậy, độ dài chuỗi axit amin của protein fiber của HAdV-3 tại Việt Nam là 320 axit amin. Kích thước này cũng tương tự so với trình tự đã công bố trước đó của HAdV-3 trên cơ sở dữ liệu NCBI. Chứng tỏ, chúng tôi đã giải thành công trình tự của gen fiber của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam với độ tin cậy cao.
Hình 9: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự của gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam
25
3.1.4. Kết quả so sánh trình tự mã hóa gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam
Sau khi thu được trình tự ADN hoàn chỉnh của gen fiber. Chúng tôi đã so sánh với trình tự genome tham khảo của HAdV-3 trên cơ sở dữ liệu NCBI, mã trình tự là NC_011203.1. Thông qua việc so sánh này, chúng tôi đã phát hiện được những biến đổi ở cả cấp độ ADN và axit amin của gen và protein fiber. Kết quả so sánh được biểu diễn trên phần mềm Bioedit (Hình 10), và được tổng hợp lại trong Bảng 6.
Bảng 6: Các biến đổi trên gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham chiếu
STT Vị trí Nucleotide Axit amin
biến đổi NC_011203.1 HAdV-3 Việt Nam
1 31432 G A S22N
2 31435 C T S23L
3 31706 A G -
4 31751 G C -
5 31815 C G Q150E
6 31904 C T -
7 31947 C T -
8 31987 C T S207L
9 32010 G C E215Q
10 32031 G A A222T
11 32034 G C D223H
12 32103 C G H246D
13 32153 T C M272T
14 32182 T C -
15 32314 G C R316T
26
Hình 10: Hình ảnh kết quả so sánh trình tự ADN và axit amin của gen fiber Như vậy, phần mã hóa gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam có 15 biến đổi ADN trên tổng chiều dài là 960 bp. Trong đó, 10 biến đổi ADN dẫn đến thay thế axit amin. Từ đó, chúng tôi đã tính ra tỉ lệ biến đổi trình tự ở mức độ ADN của gen fiber là 1,56%. Tương tự, tỉ lệ số lượng axit amin bị thay thế trên tổng số biến đổi nucleotide của gen fiber 66.67%. Cuối cùng, tỉ lệ biến đổi axit amin trên tổng số axit amin của protein fiber là 3,13%.
Để có cái nhìn rõ ràng hơn về vị trí của các biến đổi axit amin trên cấu trúc không gian của protein fiber, và đánh giá được chi tiết hơn về những tác động của các biến đổi này có thể mang lại, chúng tôi thực hiện bước tiếp theo là xây dựng cấu trúc 3D mô phỏng của protein này.
3.1.5. Kết quả phân tích cấu trúc ba chiều protein fiber của HAdV-3 tại Việt Nam Sử dụng chương trình SWISS-MODEL kết hợp với dữ liệu của ngân hàng dữ liệu protein (PDB), chúng tôi đã mô phỏng thành công cấu trúc 3 chiều của protein fiber của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt Nam. Các biến đổi axit amin được thể hiện dưới dạng tinh thể (sphere) trong phần mềm pyMOL. Có một số biến đổi không được thể hiện lên hình là do phần mềm không xây dựng được phần cấu trúc mang biến đổi đó. Cụ thể, phần cấu trúc không xây dựng được là cấu trúc trục của protein fiber.
Cấu trúc ba chiều của đầu tương tác fiber HAdV-3 ở Việt Nam với thụ thể của tế bào vật chủ, dựa trên mã truy cập trong cơ sở dữ liệu PDB là 1H7Z [15], vì đây là cấu trúc có độ tương đồng trình tự lớn nhất với trình tự fiber HAdV-3 ở Việt Nam (95,36%). Tuy nhiên, cấu trúc này không thể hiện được liên kết với domain SCR1-2 của thụ thể CD46, nên chúng tôi đã tiến hành xếp chồng cấu trúc của 1H7Z (HAdV-
27
3) với 2O39 (HAdV-11) [40] và 3L89 (HAdV-21) [13] để đánh giá mức độ tương đồng cấu trúc của chúng (Hình 11). Kết quả cho thấy rằng cấu trúc đầu tương tác fiber của 1H7Z, 2O39 và 3L89 gần như trùng khớp lên nhau cho dù trình tự axit amin của chúng rất khác biệt. Từ đó, chúng tôi đã xây dựng cấu trúc của fiber HAdV-3 ở Việt Nam dựa trên 1H7Z và thể hiện sự liên kết với các domain SCR1-2 của thụ thể CD46 của 2O39 (Hình 12B).
Hình 11: Hình ảnh xếp chồng của đầu tương tác protein fiber HAdV Chú thích: 1H7Z-màu đỏ, 2O39-màu xanh lục, và 3L89-màu xanh nước biển
28
Hình 12: Đầu tương tác fiber của HAdV-3 tại Việt Nam và domain SCR1-2 của thụ thể CD46
A. So sánh trình tự axit amin protein fiber, B. Hướng nhìn từ bên ngoài vi-rút Trong số 10 axit amin bị biến đổi, có 6 biến đổi không được thể hiện trên hình gồm: bốn biến đổi (E215Q, A222T, D223H, R316T) cũng nằm ở đầu tương tác của fiber nhưng ở vị trí không tương tác trực tiếp với thụ thể CD46, và hai biến đổi (S22N, S23L) nằm ở trục của protein fiber (phần mềm không xây dựng được cấu trúc). Bốn biến đổi còn lại (Q150E, S207L, H246D, M272T) nằm rất gần với domain SCR1-2 nên có khả năng lớn ảnh hưởng tới sự tương tác giữa đầu tương tác fiber của HAdV- 3 và thụ thể CD46 ở người. Vì vậy chúng tôi đã tổng hợp lại giá trị pI và chỉ số H của các axit amin trong 4 biến đổi này để tiện cho việc so sánh và đánh giá hậu quả (Bảng 7).
A
B
29
Bảng 7: Các biến đổi axit amin trên đầu tương tác fiber Vị trí
biến đổi
Axit amin ban đầu
Giá trị pI
Chỉ số H
Axit amin thay thế
Giá trị pI
Chỉ số H Q150E Q (Glutamine) 5,65 -3,5 E (Glutamate) 3,08 -3,5
S207L S (Serine) 5,68 -0,8 L (Leucine) 6,04 3,8
H246D H (Histidine) 7,64 -3,2 D (Aspartic acid) 2,87 -3,5 M272T M (Methionine) 5,74 1,9 T (Threonine) 5,60 -0,7
Từ những khác biệt về giá trị pI và chỉ số H như trên, biến đổi Q150E sẽ làm thay đổi nhẹ sự tích điện tại vị trí 150 vì Q và E đều là axit amin ưa nước như nhau nhưng E có tính axit và tích điện âm, còn Q là một axit amin trung tính. Tương tự, thay thế S207L sẽ làm tăng rất mạnh tính kỵ nước tại vị trí này vì độ chênh lệch chỉ số H là rất lớn giữa L (3,8) và S (-0,8). Tiếp theo là biến đổi H246D, dễ thấy H và D có chỉ số H tương đương nhau, nhưng trong khi H có tính bazơ nhẹ thì D lại có tính axit lớn nhất trong 20 axit amin, do vậy mà biến đổi này sẽ làm thay đổi rất lớn tương tác tại vị trí 246. Cuối cùng, biến đổi M272T cũng sẽ làm cho vị trí này thay đổi đáng kể tính kỵ nước do có sự khác biệt rõ ràng giữa 2 axit amin M (kỵ nước) và T (ưa nước).
Từ những phân tích trên, có khả năng cao là 4 biến đổi Q150E, S207L, H246D và M272T đã làm thay đổi liên kết giữa đầu tương tác fiber của HAdV-3 ở Việt Nam với thụ thể CD46 ở bệnh nhân. Sáu biến đổi còn lại tuy không nằm ở vị trí tương tác với thụ thể nhưng cũng có khả năng chúng có ích cho vi-rút, hỗ trợ liên kết giữa 3 monomer fiber với nhau. Tóm lại, kết quả phân tích protein fiber đã chỉ ra khả năng tương tác của HAdV-3 ở Việt Nam với tế bào chủ đã có những khác biệt so với chủng HAdV-3 tham chiếu trên thế giới. Những sự khác biệt này có thể là sự tiến hóa thích nghi để HAdV-3 tăng cường khả năng xâm nhiễm và lây lan trong cộng đồng người dân ở Việt Nam.
30